植物热激蛋白响应非生物胁迫研究进展

李广隆，刘思言，鲁中爽，么梦凡，李远强，关淑艳，姚 丹，曲 静

（吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118）

非生物胁迫（干旱、盐碱、高低温以及重金属离子等）对植物在不同生长阶段都具有很大的负面影响，扰乱植物的正常生理代谢过程和细胞的内稳态，影响植物光合作用、蒸腾作用[1-2]。农作物的减产很大程度上归因于异常的自然气候、土地盐碱化、农药及化肥的过量使用、工业废水的随意排放等非生物胁迫，提高植物对非生物胁迫的耐受性对农业发展中尤为重要[3]。

植物热激蛋白（Hsps）是在植物遭遇非生物胁迫时，激活并能大量产生的一类蛋白质。Hsps具备以下特征：（1）保守性较高，亲缘关系较远的生物体内同一家族的Hsps同源性高，但非同一家族的Hsps无明显同源性；（2）具有短时性，当植物受到非生物胁迫时，Hsps会在短时间内大量表达积累，参与胁迫应答；（3）种类丰富，在线粒体、叶绿体、内质网中都有定位，存在于不同细胞器中的Hsps具有不同的生物学功能，既可以独特发挥，又能与其他蛋白协同互作[4-5]。

植物中Hsps比其他生物更加丰富和多样化，结构保守的Hsps具有分子伴侣的功能，通过辅助蛋白质的折叠、组装、易位和降解，来维持蛋白质和细胞膜的稳定，保护植物正常生长具有积极作用[6]。在胁迫条件下，Hsps能帮助故障蛋白质重新折叠，恢复正常的蛋白质构象并因此维持细胞稳态，对保护植物在非生物胁迫中免受损害起着至关重要的作用[7]。Hsps种类繁多，基因功能覆盖广泛，在植物抗旱方面作用明显，同时在抗寒、抗盐碱、抗氧化等非生物胁迫中也起到相关作用，是作物分子育种的一类良好研究对象，深入了解该蛋白有利于转基因育种及新种质的创新。

1 热激蛋白概述

1962年意大利科学家Ritossa对高温环境下的果蝇唾液腺进行研究时，首次发现了热激蛋白[8]。1974年Tissieres将这种能被热激条件刺激而合成的蛋白正式命名为热激蛋白[9]。1992年Horwitz提出热激蛋白属于分子伴侣的一种[10]。所谓分子伴侣就是一类能介导其他多肽正确折叠，在某些情况下可暂时与其他蛋白结合，但不成为最终的功能结构，可防止蛋白有害积累的蛋白家族。热激蛋白的分子伴侣作用有助于提高植物对胁迫的耐受力[11-12]。在随后对热激蛋白的研究中，多以动物材料为主，植物中热激蛋白的研究起步较晚，尤其是在高等植物方面，但进展速度较快，目前已经在大豆（Glycine max L.）、草莓（Fragaia ananassa Duchesne）、大麦（Hordeum ulgare L.）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中克隆得到了多种热激蛋白基因[12-13]。

几乎所有的生物体内都有Hsps的存在，且高度保守。正常条件下的Hsps含量低于蛋白总量的5%，但在外界环境不利条件下，尤其是热胁迫刺激时会大量合成，约占蛋白总量的15%[14-15]。Hsps有不同的分类方式，根据其分子量大小可以分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小热激蛋白（small heat shock proteins, sHsps或Hsp20），其中高等植物中含有多达20～40种sHsps[16]。Hsps不仅参与植物对热胁迫的响应，还广泛的参与其他环境胁迫，例如水胁迫、盐度和渗透、冷和氧化胁迫[17-18]。不同类别及定位在各细胞器中的Hsps相互作用，参与不同的细胞机制。同时Hsps发挥着分子伴侣的生物学功能，在保护植物免受胁迫和重建细胞稳态方面起着重要作用[19-21]。

2 热激蛋白生物学功能

2.1 Hsp60家族

Hsp60最初是被用来描述一类进化上与大肠杆菌GroEL同源的分子伴侣，是在原核生物和真核生物的线粒体与质体中发现的一类分子伴侣，Hsp60被进一步分类为两个亚家族，第一类分子伴侣存在于细菌、线粒体和叶绿体中，例如GroE和chCpn60，第二类伴侣蛋白CCT发现于古细菌和真核生物的细胞质溶胶中。研究表明，Hsp60需要ATP水解释放能量，参与新生肽的合成及折叠，通过协助新合成和新转运的蛋白质来实现其天然构象，在蛋白质的合成过程中发挥着至关重要的作用[22-25]。

水稻（Oryza sativa）在氧胁迫的条件下，Hsp60过量表达，避免Fe/S酶释放Fe2+，保护其不被氧化，在植物抵抗氧胁迫机制中发挥重要作用[26]。叶绿体Cpn60a基因的突变体拟南芥，在胚和幼苗的发育以及叶绿体发育过程中表现出生长缺陷[27]。在转反义Cpn60b基因的烟草中，植株表型出现生长缓慢、叶片失绿、开花迟缓等明显变化。在大肠杆菌中表达来自植物海莲的CCTα蛋白可增强其对盐分和渗透胁迫的耐受性[26]。但目前对Hsp60家族生物功能的探索还有待进一步发掘。

2.2 Hsp70家族

Hsp70家族被认为是最高度保守的Hsps。Hsp70家族在动物体内修复变性蛋白、调控细胞凋亡和免疫防护等反应机制方面已有相关报道[28]；在高等植物中已经鉴定出繁多的Hsp70蛋白，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网等细胞器中，在菠菜基因组中发现至少有12个Hsp70蛋白成员基因，拟南芥基因组包含至少18个编码Hsp70家族成员的基因[29]。Hsp70家族中的一些成员是组成型表达的，这些成员参与辅助多肽的折叠和前体蛋白的运转，引导溶酶体或蛋白酶来促进不稳定蛋白的降解。

Hsp70家族中单个蛋白的特定功能可能取决于它们在亚细胞区室的不同位置，如细胞质中的Hsp70有阻止蛋白聚集，帮助蛋白折叠，维持细胞器前体蛋白结构的作用，而线粒体和叶绿体Hsp70蛋白参与前体蛋白的输入和易位[25]。分析发现Hsp70基因的过表达与植物有较强的耐热性呈正相关，并能提高植物对盐、水和高温胁迫的耐受性[30-31]。已有研究表明耐热品种的甜椒（Triticum aestivum）中CaHsp70的表达量呈上升趋势，同时可提高甜椒植株的耐热性[32]。研究还发现除高温外ABA激素也会诱导黄瓜幼苗Hsp70基因的表达，从而提高其耐热性，其原理是减少植株体内H2O2的积累[33]。

植物Hsp70 BiP蛋白在未折叠蛋白细胞反应机制（UPR）中可起到保持积累的蛋白质未折叠，从而避免在胁迫条件下的蛋白质聚集，这一结果通过在烟草中过表达Hsp70 BiP基因得到证实[6]。另外Hsp70也可能充当热激因子（HSF）介导的转录抑制因子，Hsp70与HSF之间的相互作用，负调控HSF介导的热激反应中的转录激活，Hsp70蛋白还可能通过参与调节信号转导通路中许多下游基因的表达而发挥广泛的作用[34]。

2.3 Hsp90家族

Hsp90是需要ATP参与才能发挥生物学功能的主要分子伴侣之一，占细胞总蛋白的1%～2%[35]。在植物中，已经在胞浆、内质网和质体定位Hsp90基因，这些基因与酵母和动物来源的Hsp90具有63%～71%的氨基酸同源性[36]。Hsp90的特别之处在于与之相互作用的大多数底物是信号转导蛋白，如类固醇激素受体和信号激酶[37]。最近的报告显示，Hsp90蛋白可与其他蛋白合作，包括Hip（Hsp70相互作用蛋白）、Hop（Hsp70/Hsp90组织蛋白）、p23、Hsp40（DnaJ同源物）、免疫亲合剂FKBP51/54和FKBP52以及 Cdc37/p50[38]。

尽管Hsp90蛋白在多数生物中是组成型表达的，但它们在原核生物和真核生物中的表达都随着胁迫而增加，转水稻热激蛋白Hsp90基因的大豆品种中，可以有效提高其耐干旱能力[12]；有研究显示，Hsp90还具有缓冲作用，在正常的生理条件下，遗传变异的表达被Hsp90缓冲效应所隐藏或沉默，当生物遇到胁迫环境时，Hsp90缓冲系统会暴露出存在的隐藏突变[39-40]。这种形态进化的“缓冲”作用在拟南芥中被进一步证实，用凝胶霉素处理降低Hsp90的功能，使拟南芥产生了一系列形态表型，这可能是由于Hsp90在拟南芥中起到遗传缓冲作用，释放了正常情况下的遗传变异，有助于该植物的进化适应[41]。

2.4 Hsp100家族

Hsp100家族是大型AAA ATPase超家族的成员，具有广泛的功能特性，但与其他Hsps的生物学功能有所不同，其不具有防止蛋白质聚集和错误折叠的常规伴侣功能[42]。Hsp100溶解聚集的蛋白质，并在Hsp70系统的辅助下释放，清除因错误折叠、变性或聚集引起的有害多肽，在蛋白质分解和维持细胞动态平衡过程中发挥重要作用[43]。Hsp100执行双重伴侣和调节活性，从而影响蛋白底物的最终命运，所作用的蛋白底物要么完全降解，要么展开并释放[44]。

Hsp100家族在拟南芥、蚕豆（Vicia faba）、烟草（Nicotiana）、水稻、玉米（Zea mays）、利 马 豆（Phaseolus lunatus） 和 小 麦（Triticum aestivum）等植物中均有报道。与许多其他热激蛋白一样，Hsp100家族通常以组成型在植物中表达，受到如热、冷、脱水、高盐或暗诱导等不同的环境胁迫调节。研究发现小麦幼苗、玉米等在高温胁迫下都能诱导合成 Hsp104，酵母中表达大豆GmHsp104基因，可以使酵母提高耐热能力。从蚕豆中克隆其叶绿体Hsp100基因，证实了叶绿体Hsp100基因的表达与蚕豆的热应激有关[45]。甘蔗Hsp100蛋白的产生赋予酵母有较强的耐热性，暗示Hsp100在恢复细胞应力中发挥一定作用[46]。

2.5 sHsps家族

sHsps是一类低分子量的热激蛋白（12～40 kDa）。植物中，sHsps在序列相似性、细胞定位和生物学功能方面比其他Hsps家族更加多样化。原核和真核细胞中，sHsps在热和其他胁迫下普遍合成，某些sHsps也在特殊发育阶段表达[47]。sHsps本身不能重新折叠非天然蛋白质，但在结合非天然蛋白质方面具有显著的效果，形成稳定的复合体，使其接近其他依靠ATP的成员如Hsp70，从而协助蛋白质的正确折叠和构型，以便进一步加工[14]。sHsps可能通过疏水相互作用，稳定并防止蛋白质非天然聚集，从而促进它们通过ATP依赖性伴侣蛋白（如DnaK或ClpB）的重折叠[48-49]。植物sHsps可以应对各种环境压力，包括热、冷、干旱、盐度和氧化胁迫，sHsps还与类囊体膜相互作用，参与植物抗逆[44]。在石竹中已有叶绿体sHsps重要性的相关报道。而研究发现玉米线粒体sHsps（msHsp）在盐胁迫期间显示出保护NADH，改善线粒体电子传递的作用[51-52]。过表达sHsps基因可以减轻番茄对盐胁迫的耐受性，桑树内质网sHsps的积累可以增强其对寒冷胁迫的耐受性等越来越多的研究表明，sHsps的积累与植物对压力耐受性之间存在很强的相关性[53-54]。

3 Hsps与其他应激反应机制的相互作用

非生物胁迫会引起多种反应，植物所获得的耐受性通常是多种胁迫应答机制协调作用，重建细胞内稳态，防止细胞损伤的结果[55-56]。胁迫条件下Hsps的保护作用可归因于众多伴侣的协同作用，发挥分子伴侣网络机制[57-58]。

3.1 Hsps与渗透物分子相互作用

Hsps与渗透物分子机制互作是典型的例子，渗透物（如甘氨酸，甜菜碱，甘油，脯氨酸和海藻糖）是一类小分子量的有机化合物，在生物体中积累以响应渗透胁迫，细胞通过调节不同渗透物的细胞内水平来特异性地控制蛋白质的稳定，影响蛋白质解聚和重折叠[36]。研究发现大肠杆菌中的渗透物具有增加天然蛋白质稳定性和协助未折叠多肽的重折叠来充当“化学伴侣蛋白”。对酵母的研究发现，海藻糖与Hsps相互作用，可抑制变性蛋白质的聚集，使它们保持部分折叠状态，从而恢复蛋白质功能。发现卤虫（Artemia franciscana）在热胁迫过程中和热胁迫后，海藻糖和sHsp（p26）在体外可以协同作用[59]。这些研究为Hsps伴侣蛋白与其他压力保护机制之间的相互作用提供了新见解。

3.2 Hsps与伴侣蛋白相互作用及调节细胞功能

除了渗透物外，还发现Hsp90、Hsp70家族的分子伴侣及其他伴侣蛋白与越来越多的信号分子之间有相互作用，包括核激素受体，酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸激酶，以及细胞周期和细胞凋亡调节剂，证明它们在细胞信号转导网络中发挥着关键作用[38]。哺乳动物细胞中sHsps不仅涉及对外界刺激的保护，而且还涉及其他细胞功能（例如细胞凋亡和分化）的调节，参与细胞氧化还原状态的调节[60]。虽然这些研究大多数是在植物以外的生物体内进行的，但类似的交叉互作机制可能在植物中同样发挥作用。例如在拟南芥抗氧化应激转录因子的依赖性表达中，HSF不仅参与Hsps合成，还可参与抗氧化基因表达的相关氧化应激调节[61]。然而，Hsps作为细胞氧化还原状态调节剂,参与植物其他应激反应机制仍有待确定。

4 问题与展望

每一类Hsps家族成员不但具有特定的功能，而且相互之间有着密切合作，构成不同的Hsps伴侣网络。但在复杂的细胞环境中，特定的Hsps如何识别其特定的底物（新生肽或丧失功能的蛋白），以及怎样决定每一种故障蛋白质的处理方式，是对其保持稳定还是防止聚集，是将其复性还是最终聚集并降解，是否存在Hsps伴侣网络的中心决定因素，作为调控因子，Hsps是如何参与应激感应，信号转导和应激基因的转录激活，这些问题尚不清楚。

目前植物和其他生物的大部分研究致力于检测Hsps的低表达或过表达在应激期间或之后的变化。此外在许多情况下，关于Hsps在应激下的功能的结论是基于体外测定分析的结果，这主要是因为缺乏合适的突变体，有些特定的Hsps不发生表达。未来的研究应致力于创造缺乏特异性或几种Hsps的植物突变体，并应用现有突变体的结果与之关联分析。同时在研究植物中一种或多种应激反应机制变化中，还应该对Hsps蛋白的变化、结构变化要着重分析。在今后的研究中，期望能对Hsps和其他植物中应激反应机制之间互作关系的深入研究，进而为植物获得性应激耐受性的研究提供理论依据。