猪德尔塔冠状病毒研究进展

董建国，饶 丹，覃燕灵，王艳午，张 宁，易本驰，黄 立，刘纪成，邓凯伟

（1.信阳农林学院牧医工程学院，河南 信阳 464000；2.广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场，广西 南宁 530000；3.河南丰源和普农牧有限公司， 河南 驻马店 463000）

猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）是2012年新发现的一种感染猪的冠状病毒[1]。冠状病毒分为α、β、γ、δ等4个冠状病毒属，其中α冠状病毒属和β冠状病毒属主要由哺乳动物冠状病毒组成，γ冠状病毒属主要以鸟类冠状病毒为主，而δ冠状病毒属近年新分出的冠状病毒属，在哺乳动物和鸟类中都能检测到。δ冠状病毒最早在2007年从中国白鼬獾和亚洲豹猫中检测出[2]，该类冠状病毒基因组大小为26 396～26 552 nt，为已知最小的冠状病毒[3]。PDCoV首次于2012年在香港从收集的猪粪便样本中检测到[1]。2014年初，美国俄亥俄州的猪场爆发大面积的仔猪流行性腹泻，腹泻症状以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征，经检测为PDCoV阳性，但其他肠道病毒例如猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）以及轮状病毒（PoRV）检测结果为阴性[4]。在美国的主要养猪地区也相继检测到了该新型猪冠状病毒[5-7]。随后，在韩国、加拿大猪只粪便样品中也检测到了PDCoV[8]。我国大陆地区于 2014 年首次报道检测到该病毒，迄今多个省市地区的已检测到PDCoV感染[9-10]。目前PDCoV在我国有些地区呈流行趋势，该病的发生增加了猪只肠道病毒性疾病的危害，同时也增加了猪只肠道细菌性疾病的严重性，给猪场疾病的防控带来了困难，同时造成一定的经济损失。为了对该病有详细的了解，以便于疾病的深入研究和防控，我们根据近年来研究者对PDCoV的报道，从猪德尔塔冠状病毒的基因组分析、流行现状、遗传进化分析、检测方法及防控措施等方面进行阐述。

1 PDCoV基因组特征

PDCoV 是一种具有囊膜、单股正链的RNA病毒，基因组长为25.4 kb，包含5′和3′非编码区及7个开放性阅读框，分别编码多聚酶蛋白1a/1b、纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、非结构蛋白6（NS6）、核衣壳蛋白（N）及非结构蛋白7（NS7），其中包括4个结构基因和4个非结构基因[1]。5′非编码区长度为511～540 nt，主要功能是调控病毒的转录。多聚酶蛋白基因全长约19 000 nt，占整个基因组的3/4，由两个开放阅读框（ORF）ORF1a和ORF1b组成，ORF1a和ORF1b编码多聚蛋白pp1a和pp1ab，pp1a和pp1ab进一步水解成15个非结构蛋白（nsp）参与病毒复制和转录。

2 PDCoV蛋白功能

2.1 PDCoV非结构蛋白功能

目前对PDCoV各蛋白功能研究较少，nsp5是3C样蛋白酶，Zhu等[11]证实PDCoV nsp5能够切割JAK-STAT2信号通路中的STAT2蛋白，导致STAT2降解，影响干扰素诱导基因（ISGs）的表达，进而拮抗Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ），抑制先天性免疫。非结构蛋白NS7和NS6，为PDCoV的辅助蛋白。Fang等[12]发现异位表达的NS6通过干扰RIG-I/MDA5与双链RNA的结合可阻碍干扰素β的产生，揭示了PDCoV辅助蛋白所采用的一种新策略来抵抗宿主先天抗病毒免疫应答。NS7特异性单克隆抗体（MAb）能够识别来自PDCoV感染的细胞裂解物，但不识别NS7 异位表达的细胞，后通过实验证明该蛋白条带代表1个新的辅助蛋白，称为NS7a。此外，Fang等还证实NS7a由独立的亚基因组mRNA编码，具有非经典的转录调节序列[13]。

2.2 PDCoV结构蛋白功能

目前尚未有关PDCoV结构蛋白（S、N、E和M）功能的研究报道。在其他冠状病毒中，PEDV的S蛋白在病毒与细胞受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞的过程中发挥重要生物学作用，N蛋白在病毒复制过程中起重要作用。TGEV和PEDV的M蛋白对构建病毒颗粒起重要作用，还具有抗干扰素活性的功能[14-15]。PEDV的E蛋白在病毒粒子的组装及出芽释放到细胞外发挥重要作用[16]。PDCoV 结构蛋白的生物学功能有待进一步研究。

3 PDCoV流行现状

3.1 国内外地区PDCoV流行情况

PDCoV可引起母猪和仔猪腹泻症状，以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征，各年龄段猪群均易感，发病仔猪中的死亡率为30%～40%[4,17]。2012年，Woo等[1]首次在香港从猪腹泻猪粪便中检测到PDCoV，研究显示169份样品中有17份样品为PDCoV阳性。随后，该病于2014年2月在美国俄亥俄州暴发，至今该病已经蔓延至美国20多个地区[18]。同年6月，在加拿大安达罗湖周边的5个猪场中检测到PDCoV。对美国以及加拿大部分地区猪场的293份样本进行PDCoV检测，有30%（89/293）的样本呈PDCoV阳性[6]。这些结果表明PDCoV在北美国家广泛传播，给猪场造成了巨大经济损失。此外，亚洲国家韩国和东南亚国家泰国均检测到PDCoV，且泰国阳性率高达87%[19-20]。我国学者对国内PDCoV的流行情况进行了广泛的调查，张帆帆等对2012—2015年从江西省各地区采集的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/小肠组织样品进行检测，结果显示2012年的腹泻样品中能检测出PDCoV，2012—2015年间江西PDCoV阳性率为31.33%（78/249）[21]。Zhai等[22]对采自广东、海南共15个猪场390份粪便样品进行PDCoV病原检测，检测阳性样品阳性率为1.28%（5/390）。这些检测结果表明不同地区PDCoV阳性率存在差异，PDCoV在腹泻样品中的检测率可大于30%，引起仔猪死亡率为30%～40%，与PEDV相比死亡率要低些。有学者对在我国安徽、广西、湖北和江苏4个地区收集的215份样本（2004—2015年）进行PDCoV检测，发现样本中14份（6.51%）呈PDCoV阳性，110份 （51.2%） 为PEDV阳性，5份（2.3%）为TGEV阳性；14份PDCoV阳性样品中，有7份（50%）同时是 PEDV阳性，2份样品同时是 PEDV、TGEV和PDCoV阳性，阳性样品最早采样时间是2004年[23]。宋亚兵等[24]对2012—2016年间采集的420份猪腹泻病料样品进行PDCoV抗原检测，PDCoV阳性率为13.33%，与PEDV混合感染率为5.95%。这些结果表明PDCoV不仅单独感染猪只，还与PEDV和TGEV混合感染，且与PEDV混合感染率较高。我国最早检测到PDCoV样品年份可追溯到2004年，说明该病毒很早就在我国猪群中存在却未被发现。这些研究结果提示我们需要加强对PDCoV以及其他猪肠道病毒性腹泻的长期监测，及时发现疫情加以防控，以防止疾病蔓延。

3.2 PDCoV季节流行特征

宋亚兵等[24]检测的420份猪腹泻病料样品中，春、夏、秋、冬4个季节中PDCoV阳性病料样品占比分别为35.7%、10.7%、12.5%、41.1%，表明冬春季节是该传染病的高发季节，PDCoV的发生呈现明显的季节性。这是由于冬春季节气温变化幅度较大，出生仔猪抵抗力较弱，易产生应激，造成肠道功能紊乱，导致病毒性腹泻发生。这与PEDV、TGEV和RV等引起腹泻的发病季节类似。因此，冬春季节应加强该病的防控工作，及时补液，加强饲养，注意温度变化对仔猪腹泻的影响。

4 PDCoV遗传进化分析

目前GenBank已收录了近100条猪δ冠状病毒全基因组的序列，来源于美国、中国、韩国、老挝、越南、泰国、日本等，系统发育和进化树分析显示这些毒株的同源性很高，遗传进化关系非常亲近，可能起源于同一毒株。其中，美国毒株与韩国毒株KOR/KNU14-04/2014的S基因核苷酸序列最接近，核苷酸同源性为99.5%～99.9%，全基因组核苷酸序列同源性为99.6%～99.9%，且没有基因序列的插入或缺失[25]，遗传进化树分析发现美国毒株与韩国毒株KOR/KNU14-04/2014处于同一分支，表明它们可能起源于同一毒株；韩国毒株与香港毒株HKU15-44和HKU15-155存在98.8%～99.0%基因相似性，与美国毒株存在99.6%～99.8%基因相似性，这也表明韩国毒株与美国毒株亲缘关系更相近[8]；中国大陆毒株（CHN-AH-2004、CHN-HB-2014和 CHNJS-2014）与先前所有报道PDCoV株的核苷酸同源性在98.9%以上。香港株HKU 15-44与美国株及韩国株在S基因上均有3 nt的插入，但香港株HKU 15-155没有这一插入；CHN-AH-株也同样有这个插入，然而CHN-HB-2014株和CHNJS-2014株像HKU 15-155株一样缺少这个插入[21]。系统进化树分析表明老挝BTL-0115毒株与美国及中国毒株均不在一分支上，但是与中国株亲缘关系更近[26]。基于全因组的遗传进化分析表明，2014年在日本检测到的7株PDCoV毒株与2013—2016年美国和韩国分离的毒株的基因相似性一致[27]。表明不同地区PDCoV已经发生广泛的变异，且变异主要集中在S基因上。因此，及时开展针对PDCoV S基因的遗传变异分析，分析突变碱基对病毒致病性的影响，对于研发有效的疫苗防控该病具有重要意义。

5 PDCoV检测方法

5.1 抗原检测方法

PDCoV引起的临床症状和病理变化与猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎相似，一般很难通过肉眼观察辨别，需要借助实验室诊断方法确诊。在病原检测方面，借助电子显微镜，可以观察到病毒超微结构形态，PDCoV在电镜下呈球型带囊膜的颗粒，直径120～180 nm[17]，结合病猪出现腹泻、呕吐、脱水等临床症状进行诊断。RT-PCR是检测病毒核酸常用的方法之一，除了传统的RTPCR外还有套式RT-PCR、实时荧光定量PCR、多重RT-PCR以及恒温RT-PCR等。由于PDCoV的N基因和M基因高度保守，大部分的RT-PCR检测技术都是针对这两个基因建立的。张帆帆等[22]设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物，建立了一种检测PDCoV的RT-PCR方法。逄凤娇等[28]根据保守的M 基因建立了RT-PCR 的检测方法。此外，针对PDCoV与PEDV和TGEV混合感染情况，也建立了一系列的多重PCR检测方法。刘玲玲等[29]建立了检测PDCoV和TGEV的双重RT-PCR检测方法；任玉鹏等[30]建立了同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法；Song等[10]根据N基因设计内套和外套两对引物，在中国大陆首次建立套式PCR技术，完成了PDCoV感染情况调查并率先报道了1株 PDCoV全基因序列。荧光定量PCR技术作为一种新的PCR技术，具有检测灵敏度高、特异性强等优点，受到了广泛的应用。Marthaler等[6]建立了基于SYBR green染料法的实时荧光定量检测方法，检测猪群中PDCoV感染情况，并同时检测了其他腹泻相关病原，发现猪群中存在不同程度的混合感染；Wang等[31]建立实时荧光定量PCR用于临床样品的检测，对2014—2015年中国10个省份收集的254份样品进行检测，检测阳性率为4.33%。此外，Masuda等[32]建立了可同时检测PEDV、PDCoV、TGEV、PRV 等4种腹泻相关病原的四重实时荧光定量PCR，检测灵敏度比普通RT-PCR方法高1 000倍。LAMP具有方便、快速和灵敏等优点，Zhang等[33]建立了检测PDCoV的RT-LAMP方法，对比检测192份临床样品，该方法检测灵敏度高于套式PCR和常规RT-PCR。由此可见，PDCoV抗原的PCR检测方法国内外都已有很多报道，不仅有针对PDCoV的单重RT-PCR和荧光定量PCR检测方法，还有针对各类引起猪腹泻病毒的多重RT-PCR和荧光定量PCR检测方法，这为病毒的检测提供了很便利的方法参考。

5.2 抗体检测方法

在检测抗体方面，近年来也有许多关于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验（IFA）等的报道。Faten等[34]通过表达N基因的重组蛋白建立了检测抗体的间接ELISA方法、荧光微球免疫技术（FMIA）和间接IFA技术，检测敏感性和特异性均达95%以上。Luo等[35]基于M基因表达的重组蛋白建立的间接ELISA方法，检测敏感性和特异性分别为90.6%和93.3%，通过对河北省40个猪场共871份血清进行监测，结果显示血清抗体阳性率为11%（96/871），阳性猪场率为25%（10/40）。Thachil等[7]建立了一种间接抗PDCoV IgG ELISA方法，该方法是基于S1部分的刺突蛋白而建立的，检测敏感性和特异性分别为91%和95%，血清抗体阳性率为8.7%，阳性猪场率为25.5%，该报道还发现PDCoV抗体阳性率低于PEDV阳性率（22.8%）。这些抗体检测方法的建立为及时掌握猪场猪体内PDCoV抗体水平，全面反映畜群中疾病的感染情况、免疫水平、流行特点等提供重要的科学依据。

6 PDCoV防控措施

引起猪病毒性腹泻的病原有PEDV、TGEV、PoRV、猪伪狂犬病病毒（PRV）及PDCoV等，但目前尚无针对PDCoV的商品疫苗，且对于采用干扰素、鸡卵黄抗体等特异性抗病毒治疗的报道也较少。

病毒性腹泻病原可以是一种或多种，这样就使得实际诊断复杂化，需要借助实验室的一些诊断方法。对于腹泻猪需要科学地进行护理，如对腹泻猪进行收敛止泻、补液和纠正酸中毒的治疗，都能减少患猪的死亡。防控病毒性腹泻首先应加强饲养管理。通过给予饲喂营养丰富的全价饲料以提高机体的免疫力与抗病力；保持猪舍清洁卫生和干燥，严格舍内消毒和周边环境的消毒，冬季寒冷季节注意保温，产房和保育舍保持适宜温度和湿度，适当通风换气；建立完善的生物安全体系，场内外车辆、人员、物料、猪等的转移需严格把控。PDCoV主要引起仔猪的腹泻，重点防控对象为哺乳仔猪与保育猪，该病没有相关有效的疫苗进行预防，疾病发生时主要是补液补盐，同时防止激发感染，再者需要做好猪舍的消毒工作和应激工作，具体防控措施可参照同样由冠状病毒引起的猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎的防控方法。

7 展望

近几年猪场肠道性疾病不断发生，特别是近年来引起相似症状的与PDCoV同科的变异毒株PEDV的爆发，引起了研究者和饲养人员的注意，随着各种猪肠道病毒性腹泻病的发生，外界环境的复杂和仔猪体抗力的下降，越来越多的猪场相继爆发PDCoV，给养殖业造成了一定的危害和经济损失。目前针对PDCoV病毒蛋白如何调控宿主机能，利用宿主机制逃避免疫反应，利于病毒自身存活和增殖的研究较少。PDCoV有许多非结构蛋白，这些非结构蛋白在病毒复制和转录中具有重要作用，它们的具体功能如何，是否有与免疫调控相关的病毒蛋白存在，能否根据这些与免疫调控相关的病毒蛋白研制新型亚单位疫苗，通过病毒自身蛋白直接调控宿主免疫系统进而对疾病本身进行预防；同时遗传变异分析显示S基因容易发生变异，存在碱基的插入或缺失，这些碱基的插入或缺失是否影响病毒毒力，是否与中和抗体的水平变化呈线性相关，随着研究的深入，相信研究者在这方面会有详细的阐述。