APOBEC3C的研究进展①

吴小霞

(琼台师范学院数理系，海口 571100)

载脂蛋白BmRNA编辑催化样蛋白3(The apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like 3，APOBEC3，A3)家族有七个成员，包括APOBEC3A(简称A3A)、APOBEC3B(简称A3B)、APOBEC3C(简称A3C)、APOBEC3D(简称A3DE)、APOBEC3F(简称A3F)、APOBEC3G(简称A3G)及APOBEC3H(简称A3H)，均对ssDNA(single-strand DNA，单链DNA，简称ssDNA)有胞嘧啶脱氨酶活性，可抑制宿主体内的逆转录元件、逆转录病毒和其他一些产生ssDNA中间体的DNA病毒的复制[1-7]。

A3C是人类A3家族中几乎没有抗病毒和抗逆转录元件功能的成员。在比较人类七个A3蛋白抗慢病毒及逆转录元件功能的研究中也发现，A3C确实是唯一一个功能较弱的成员[1]。

A3C是较弱的人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)抑制因子，但是，A3C却是强大的抗Vif缺陷的猴免疫缺陷病毒因子(Simian immunodeficiency virus，SIV)。A3C可在HIV-1的靶细胞表达，包括外周血单核细胞、巨噬细胞及胸腺细胞[8]。事实上，A3C可在多种组织表达，也是所有A3基因中表达最丰富的。有研究证实在A3C的表达细胞，Vif表达时能检测导致病毒多样性的G→A 突变[2，3，8]，尽管G→A 突变不能抑制病毒复制。

人类A3C具有S188I多态性，A3CI188增加了蛋白质的酶活性及其抑制HIV-1 的能力，A3CS188单体的抗病毒功能虽然不强，但是A3CS188二聚体的抗病毒功能显著增强，甚至超过了A3CI188，二聚化是决定A3C功能的关键因素。Wittkopp等[1]发现A3C在灵长类的正选择下进化，并在A3C:Vif的结合界面进化，这暗示A3C在病毒防御中起重要作用。人类A3C虽然不能强烈抑制慢病毒复制，但灵长类A3C已作为抗慢病毒蛋白进化，说明A3C是病毒在天然感染过程中必须对抗的重要屏障，对A3C蛋白结构的研究可能在控制病毒感染方面有治疗作用[1]。Bourara等[8]发现利用RNA干扰在Magi细胞抑制内源A3C可防止病毒突变，认为A3C引发的突变导致了病毒多样性，因此，从免疫抑制或抗逆转录病毒抑制方面考虑，发展抑制A3C的药物或许是一种新的延迟病毒逃逸的策略。总之，对A3C研究的深入，可为进一步了解免疫治疗并最终治愈相关疾病带来希望。

1 APOBEC3C的多态性

Wittkopp等[1]发现A3C与其余6个已知功能的A3s在同源的188位氨基酸有差异，A3C在此位置编码丝氨酸(ser)，其余6个均为保守的异亮氨酸(Ile)。当二者的表达水平相同时，A3CI188抑制Vif缺陷HIV-1(Δvif)感染的能力几乎是普通A3CS188的十倍[1]。

群体遗传学显示人类A3CI188 多态性是古老的，A3CI188以约10%的频率出现在不同的非洲人群，而在其他人群却不出现。研究者们认为可能是在人类进化中188位的异亮氨酸丢失了，但是在人类和黑猩猩距离最近的共同祖先分离之后又被某些人类重新获得；也可能是I188作为等位基因从未丢失，只是在人类几百万年的进化中一直作为一种多态性存在[1-4]。

Adolph等[4]发现人类A3C编码S188I的多态性增强了蛋白质的酶促活性及抑制HIV-1的能力，并使其更易形成二聚体。但是，其他的人科A3C蛋白只有一个不太活跃的S188，就像人类A3C的普通形式一样。尽管如此，黑猩猩和大猩猩的A3C具有与人类A3CI188几乎一样的功能，而且黑猩猩和大猩猩的A3C是在与人类A3CS188I相同的界面形成二聚体，只是利用了不同的氨基酸。最重要的是，每个人科A3C蛋白的二聚化都能增加ssDNA的持续合成能力，从而导致体外和细胞内逆转录过程中的大量突变，这是决定A3C功能的关键，因为两个A3CS188二聚体的抗病毒功能明显增强，即使与比较活跃的A3CI188相比， A3CS188二聚体的功能也是增强的[1,4]。

2 APOBEC3C的结构

A3蛋白都有1个或2个胞嘧啶脱氨酶域(Cytidine deaminase domains，CDD)。CDD为典型的锌离子协调基序(H-X-E-X23-28-P-C-X-C)，在其活化位点有一个水分子结合Zn2+而金属离子被一个组氨酸(His)和两个半胱氨酸(Cys)协调[3,7,9,10]。A3C只有一个CDD。根据锌离子协调基序进行分类，可将A3分为Z1-A3A家族，包括A3A和A3B及A3G的C-末端域；Z2-A3C家族，包括A3C、A3DE和A3F的C-端和N-端域；A3H是唯一一个Z3锌指域。A3蛋白以单体、二聚体和寡聚复合物的形式出现[9,10]。

Vasudevan等[7]利用NMR和X-射线晶体结构显示6个α-螺旋和5个β片层组成的球状体(α1-β1-β2/2′-α2-β3-α3-β4-α4-β5-α5-α6)是DNA脱氨酶特有的基序。Siriwardena等[7]利用ENDscript 2 software26对比了代表性的A3家族成员的结构并识别出家族常见的结构组成。A3蛋白具有很多反映其序列相似性的二级结构，其三级结构都在中心具有一个被三个螺旋围绕的β 片层。A3蛋白结构的区别主要在于A3C、A3F和A3A都具有连续的β2 链，该链在A3B和A3G结构中却被α 螺旋或β转角中断。

Desimmie等[12]确认A3C的晶体结构形成一个与Vif结合的凹陷，位于界面的凹陷由A3C疏水性残基(L72、I79和L80)、芳香族残基(F75、Y86，F107和H111)和亲水性残基(C76，S81，E106)组成。

也有研究证实不同血统的Vif与A3C有不同的结合位点，HIV-1的 Vif 对猕猴(rhA3C)、白眉猴(smmA3C)及非洲绿猴的A3C是没有活性的，rhA3C与 smmA3C上的N/H130 和 Q133残基是决定其抗HIV-1Vif的重要因素，HIV-1Vif 与hA3C螺旋4连接，与hA3F 不同[13]。

APOBEC家族具有较强的特殊碱基偏好性，位于靶胞嘧啶的5′端而不是3′端。A3G偏好CCC，其他的家族成员以YC(Y是嘧啶)序列为靶，并伴有T作为嘧啶的偏好[5,7,14]。研究证实loop7就是APOBEC酶序列特异性的主要决定因素，loop1、loop3和loop5也与DNA结合有关[7]。

Shandilya等[15]发现与结合Vif的所有A3s都有一个带负电荷的表面区域，而具有催化活性的A3s都在锌离子调节活性位点周围有一个带正电的弯曲，这可能是为了适应带负电荷的核酸底物。因此，底物适应区的空间范围是决定A3s蛋白与Vif结合及其与底物结合的关键因素，可以在此进行抗病毒和抗癌症的治疗设计。

3 APOBEC3C与HIV

HIV基因突变的一个重要机制是逆转录过程中的G→A突变。G→A突变已在HIV-1感染患者中检测到至少43%，并且是在持续复制的环境下发生突变[8]。这些突变主要是由DNA编辑酶家族介导，如A3家族。A3蛋白被包装进入病毒粒子，并在病毒RNA逆转录过程中使得负链DNA上的胞嘧啶C脱氨基成为尿嘧啶U从而产生无感染性的病毒粒子。A3G引起高频率的GG→AG突变，A3B和A3F引起GA→AA突变，而A3C主要作用于GA和GG、GA的偏好性强于GG[8]。

A3C也在HIV-1病毒粒子被检测到，A3C抗HIV-1功能较弱。与A3G相比，A3C诱发HIV-1DNA上胞嘧啶脱氨基的数目极少，所以降低了A3C抑制HIV-1逆转录及整合的能力[8]。Wang等[11]在研究中发现了决定A3C包装的HIV组成，即HIV-1 Gag的MA域对Gag和A3C之间的相互作用以及A3C的有效包装非常重要，而HIV-1Gag的NC域，以及减少7SLRNA包装进入HIV-1病毒粒子并不影响A3C的包装。Desimmie等[5]证实A3s蛋白共同包装进入HIV病毒粒子能并发突变相同的基因组，相互协作共同抑制HIV复制。

Vasudevan等[16]证实人类A3C.S61P突变增强了SIVΔvif和鼠白血病毒病毒(Murine leukemia virus，MLV)病毒基因组的超突变，却不能增强HIV-1Δvif的超突变。S61P突变并不能改变A3C的底物特异性、核糖核蛋白蛋白复合物的形成、锌协调或病毒包装的特点，S(丝氨酸)→P(脯氨酸)诱导的局部结构改变导致了A3C.S61P催化活性的增加[16]，因此，A3C.S61P抗病毒功能的增强与体外胞嘧啶脱氨酶活性有关。

4 APOBEC3C与其他病毒

慢病毒进化出Vif 蛋白来对抗A3抑制因子，并以多聚泛素化和蛋白酶体降解的方式诱导其降解[1,4,6,7,13,17]。尽管A3C能抑制HIV-1感染的假说仍有争议[7]。但是，A3C却能强烈抑制Vif缺陷的SIV[8,16]。

泡沫病毒也进化出了有效的附属蛋白Bet对抗A3蛋白，泡沫病毒的Bet利用一种不同于Vif的机制抑制了A3C的抗病毒功能，即Bet与A3C形成的复合体抑制A3C的二聚化，却不能诱发其降解[2]。

单纯疱疹病毒类型1(Herpes simplex virus 1，HSV-1)和爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)可能在Hela 细胞容易被A3C编辑，而A3C利用转染实验过度表达导致HSV-1病毒滴度和感染性的降低[7]。被编辑的EBV DNA也在感染的外周单核细胞系被发现与A3C的大量表达有关[7]。

乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染肝细胞导致细胞因子和多种A3蛋白表达[7]。HepG2细胞被共转染进HBV表达质粒、编码融合蛋白核心-A3C以及绿色荧光蛋白GFP的质粒。融合蛋白核心-A3C对HBV的DNA水平有实质的影响。在表达融合蛋白核心-A3C的HepG2细胞，G→A突变的数目显著增加，其他的核苷酸替换比较少。另外，融合蛋白核心-A3C在细胞内和细胞培养上清液中也显著抑制HBV复制[18]。

全基因组测序研究显示A3特异性的突变标签在病毒基因组TCW序列背景下是C→U或C→T突变，且常为成簇突变。另外，这些突变簇的TCW序列倾向于在相同的DNA链上以C为靶，被称为链协同突变现象。大约15%～20%的人类癌症是病毒引起的，这些肿瘤病毒遍布在DNA和RNA病毒家族，包括HPV、EBV和丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)等[7]。

5 APOBEC3C与逆转录元件

A3C对non-LTR 逆转录元件都有强大的抑制作用，尤其是长散在细胞核元件(Long-interspersed nuclear element，LINE-1,简称L1)和Alu元件[7,18]。

L1约占人类基因组的17%，编码三个蛋白质，即新识别的未知功能的ORF0，具有RNA结合功能的ORF1P，以及有内切酶活性并对L1逆转座具有逆转录酶功能的ORF2P，L1已被证实是单基因遗传病的一个诱因[19,20]。L1编码的核酸内切酶能切除可能导致基因组DNA不稳定的双链断裂(Double strand breaks，DSBs)[19,20]。

Horn等[19]利用L1核蛋白颗粒的密度梯度离心、L1-ORF1p和A3C的亚细胞共定位以及免疫共沉淀实验揭示A3C介导的L1抑制机制，即A3C利用RNA依赖的A3C/ORF1p的相互作用抑制L1逆转录， 但是A3C必须二聚化，RNA结合凹陷突变R122A可消除APOBEC产生的L1抑制。

6 结语

A3s家族利用病毒负链DNA的C脱氨基作用成为U从而导致病毒失活，并不同程度地抑制了HIV等病毒的复制。与A3家族的其他成员相比，A3C抑制病毒和内源性逆转录元件的功能较弱，但是A3C在多种组织的表达却是所有A3基因中最丰富的。人类A3CI188增加了蛋白质的酶活性及其抑制HIV-1 的能力，A3CS188单体的抗病毒功能不强，但是A3CS188二聚体的抗病毒功能明显增强，甚至超过了A3CI188。A3CI188在非洲人口广泛分布，是灵长类祖先等位基因，但是在黑猩猩和大猩猩中没有发现。当其他原始人类丢失这一抗病毒基因的功能时，一部分人类依然保持或重新获得作为一个更活跃的抗病毒基因。总之，A3C作为病毒天然感染过程中必须对抗的重要屏障，确实与保护宿主抵御慢病毒有关，对A3C研究的深入，可能会对相关疾病的治疗提供新的思路。