microRNA在自身免疫及血管炎性疾病发病中的作用①

罗叶萍 杨作成

(中南大学湘雅三医院儿科，长沙 410013)

血管炎是指血管壁及血管周围炎细胞浸润，并伴有血管损伤，包括纤维素沉积、胶原纤维变性、内皮细胞及肌细胞坏死，又称脉管炎。1947年Li建议将血管炎分为原发性和继发性两大类。原发性血管炎包括川崎病(Kawasaki disease,KD)等，继发性血管炎包括继发于结缔组织病的血管炎如：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)、幼年特发性关节炎(Juvenile idiopathic arthritis,JIA)等[1]。多数血管炎的病因不清楚，发病机制尚未完全明了。在其免疫学和血管功能方面，从细胞和分子水平的研究已有了很大进展。近年来许多研究发现微小RNA(microRNAs,miRNAs)在部分系统性血管炎的发病机制中发挥重要作用，如SLE、 JIA、 KD和白塞病(Behcet disease,BD)。

miRNAs是一类保守的非编码小分子RNA，可与mRNA分子3′非翻译区(Untranslated regions,UTR)结合，在转录后水平调节多种蛋白质的表达。在生理过程中，miRNAs参与细胞的分化、增殖、凋亡和内稳态等。在病理条件下，异常表达的miRNAs通过对基因的调控参与疾病的致病过程。尽管miRNAs只占人类基因组的3%，却调控大约90%的基因[2]。包括与自身免疫和血管内皮细胞功能相关的基因和信号通路等[3,4]。在过去十多年的研究中，大量的证据表明miRNAs网络表达紊乱在自身免疫疾病如SLE等的发病机制中发挥了重要作用，但miRNAs在大部分系统性血管炎性疾病中的研究仍然处于初级阶段，许多miRNA分子的靶基因及其分子作用机制仍不清楚。为进一步认识miRNAs在自身免疫性疾病及血管炎性疾病发病中的作用，现对miRNAs参与其中的作用机制综述如下。

1 miRNA与免疫耐受

miRNAs对机体免疫耐受的形成发挥着重要作用。在免疫细胞自身免疫耐受形成过程中，miRNAs参与了与自身免疫相关的基因和信号通路的调节。其中，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是miRNA调控自身免疫的重要信号通路[5]。在B淋巴细胞的发育过程中,miRNA-17～92族发挥了重要作用[6]。研究发现miRNA-17～92族对B细胞的作用可通过调节PI3K信号通路及其下游多个基因，如促凋亡分子BIM基因[5]。miRNA-17～92族还可靶向PI3K信号通路的负调节因子PTEN基因。抑制B细胞中miRNA-17～92族的表达，可使BIM和PTEN蛋白上调，促进B细胞的凋亡。相反，B细胞中miRNA-17～92簇表达上调时，抑制B细胞凋亡，使外周自身反应性B淋巴细胞增多，导致自身免疫的发生[7]。Palacios等[8]发现在慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)的部分成熟B细胞中miRNA-22表达上调，使PTEN的表达降低，PI3K信号通路激活。最近，在白血病相关的部分研究中还发现，miRNAs可通过间接调节PI3K信号通路调节B细胞抗原受体(B-cell receptor,BCR)，导致自身免疫的发生。Mraz等[9]研究发现在CLL细胞中，miR-150表达下调。其作用机制为miR-150可靶向GAB1和FOXP1基因mRNA的3′UTR。衔接蛋白GAB1通过PI3K途径增强B细胞的BCR信号，影响免疫耐受的形成[10]。MiRNAs还可通过PI3K信号通路影响T细胞免疫耐受形成。Henao-Mejia等[11]。研究发现miR-181缺乏小鼠的胸腺和外周缺乏成熟的自然杀伤T细胞(Nature kill T cell,NKT)。其机制为miR-181通过调节PTEN磷酸酶控制PI3K信号。Treg细胞介导的外周免疫耐受在阻止自身免疫的发生中发挥重要作用。PI3K信号通路异常可影响CD4+T细胞分化为辅助T(T-helper,Th)细胞和Treg细胞[5]。在Treg中激活PI3K信号可阻止Foxp3的表达[12]。以上研究表明，不同miRNAs可通过PI3K途径对免疫耐受形成的多个环节进行调节，影响机体免疫耐受的形成。另外，miRNAs还可通过对mTOR、Notch等其他信号通路的调节参与免疫耐受。Dicer缺陷型CD4+T细胞中mTOR信号活性增加，TCR信号的阈值降低，miRNA调节T细胞中mTOR通路组分的表达，且这种调节是调节mTOR信号活性的关键[13]。miRAN-150通过靶向Notch受体家族的成员Notch3，在调节正常T细胞的发育过程中发挥重要作用[14]。

2 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病B细胞功能紊乱中的作用机制

在SLE中，循环免疫复合物在血管壁沉积和原位免疫复合物形成可导致血管炎症。过度活化的B淋巴细胞可使自身抗体生成增多。miRNAs引起B细胞功能紊乱参与SLE的致炎过程。SLE患者的B细胞中miRNA-1246下调和miRNA-30a过表达可使B细胞过度活化。Luo等[15]发现miRNA-1246靶向早期B细胞因子(Early B cell factor,EBF)1 可抑制其表达。相反，在正常B细胞中抑制miRNA-1246的表达可使EBF1表达上调，使B细胞表面的共刺激分子CD40、CD80和CD86增加，增加B细胞的活化。活化的B细胞还可通过激活AKT-p53信号通路降低miR-1246的表达，反过来促进B细胞活化。SLE患者B细胞中miRNA-30a的上调可直接抑制靶基因Lyn的表达，促进B细胞增殖和IgG抗体产生，参与SLE的致病过程[16]。Wu等[17]研究发现在SLE患者的B淋巴细胞中，miR-7、 miR-21、miR-22表达上调，它们可使PTEN的表达降低，促使B细胞过度活化，其具体的机制尚不清楚，但与健康对照组相比PTEN在SLE患者B细胞中表达下调，且其表达水平与SLE疾病活动度呈负相关。

3 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病T细胞功能紊乱中的作用机制

在自身免疫血管炎性疾病中，对miRNAs介导的免疫功能紊乱的研究大部分在T细胞中。 在SLE中，miRNAs可参与CD4+T细胞表观遗传学的修饰和T细胞功能的调节。CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞在调节机体正常免疫功能中起关键作用[18]。miRNAs可直接作用于Foxp3 mRNA的3′UTR、相关信号通路或基因间接影响Foxp3的表达，从而使Treg减少，在SLE和KD的发病过程中发挥重要作用。miRNAs还可影响Th细胞的分化参与SLE、JIA和BD的致病过程。

3.1miRNAs在SLE表观遗传学中的作用 SLE患者CD4+T细胞中 DNA甲基化广泛降低，可导致自身反应性T淋巴细胞克隆。miRNAs可通过不同的方式下调T细胞DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的表达降低DNA甲基化。 miRNA-126与DNMT1 mRNA的3′UTR结合、miR-148a调节DNMT1的编码区，二者均可直接降低DNMT1的表达[19,20]。miRNA-21通过靶向自身免疫相关基因RASGRP1，调节DNMT1上游的Ras-MAPK信号通路[20]，miR-29b通过抑制DNMT1的反式激活因子Sp1[21]，二者通过不同的调节方式间接下调DNMT1的表达，最终降低DNA的甲基化。

3.2miRNAs在SLE患者T细胞中的作用 T细胞增殖、CD40L和ICOS蛋白表达升高、IL-4、IL-10和IL-21蛋白表达增加为T细胞活化表型。miRNA-142-3p/5p的表达下调或miR-21的过表达在SLE患者的CD4+T细胞中均可使T细胞过度活化，并使B细胞产生的IgG抗体增多。MiRNA-142-3p/5p表达下调可使相应靶基因CD48、SAP的mRNA水平升高，而miR-21的过表达，则抑制靶基因PPCD4的表达[22,23]。PPCD4是IL-10的抑制剂。因此，miR-21对PPCD4的抑制可促进T细胞IL-10分泌增多[24]。miR-410通过与信号传导和转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)3 的mRNA的3′UTR结合STAT3的表达，降低IL-10的分泌。在SLE患者CD3+T细胞中miR-410表达下调通过增加STAT3活化，使IL-10分泌增多，增加T细胞活化[25]。 另外，Th17细胞在维持自身免疫中发挥重要作用，Liu等[26]发现在SLE患者外周血单核细胞中(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)miR-873表达上调。其主要作用机制是miR-873通过抑制靶基因叉头框(Forkhead box,Foxo)1的表达促进Th17细胞的分化。在SLE患者Treg中，Sun等[27]发现miR-326显著上调，且与Ets-1(E-Twenty-six-1)的mRNA呈负相关。MiR-326可与Ets-1 mRNA的3′UTR结合抑制其的表达。且在SLE患者Ets-1缺乏可降低CD4+CD25+Tregs中的Foxp3 mRNA。FoxP3是Treg细胞生成和发挥功能的关键转录因子之一。说明SLE患者miR-326表达上调可能抑制Ets-1的表达，从而抑制CD4+CD25+Tregs的功能。

3.3miRNAs在JIA患者T细胞中的作用 sJIA患者体内的Th17/Treg细胞失衡，Th17细胞比率升高，Treg细胞比率降低。JAK/STAT信号通路参与sJIA的发病过程。IL-6与JAK受体结合使STAT3磷酸化，诱导下游炎症相关基因表达[28]。活化的STAT3还可促进Th17细胞分化，刺激炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6产生[29]。Li等[30]通过RT-qPCR检测，发现sJIA患者外周血单核细胞(PBMCs)中miR-19a和miR-21表达下调，而与JAK/STAT3信号通路相关的STAT3、细胞信号转导抑制因子(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)3、TNF-α、IL-6增加。研究表明miR-21与T细胞的成熟和分化有关，不仅在调节Th1和Th2的相互作用中发挥重要作用[31],在类风湿关节炎患者中miR-21表达下调可使STAT3活化，使Th17/Treg细胞失衡[32]。

3.4miRNAs在川崎病患者Treg细胞中的作用 FoxP3在川崎病急性期的Treg细胞中降低。Ni等[33]发现miR-155和miR-21在川崎病急性期的Treg中表达上调，而miR-31表达下调。同时，急性期患者血浆中IL-6、pSTAT3和SOCS1的水平升高，pSTAT5的水平降低。研究结果表明Treg细胞中miRNA-155表达上调可降低SOCS1的表达，增加STAT5的磷酸化[34]。磷酸化的STAT-5与FoxP3基因的启动子结合增加FoxP3的转录，使FoxP3的水平升高[35]。因此，川崎病患者急性期Treg中miR-155的下调可能通过影响SOCS1/STAT5信号通路导致FoxP3+Treg减少。miR-31可直接与FoxP3 mRNA 3′UTR结合抑制FoxP3的翻译[36]。以上研究结果表明川崎病急性期Treg的减少可能与miR-155/SOCS1信号通路的异常和miR-31的过表达有关。

3.5miRNAs在BD患者T细胞中的作用 在BD伴有急性葡萄膜炎的急性期患者中，Notch信号通路被激活，STAT3磷酸化水平增加。STAT3磷酸化可增强Th17细胞应答。在BD患者急性期中CD4+T细胞miR-23b表达下调，miR-23b与Notch信号通路的激活和Th1/Th17细胞增加有关[37]。

4 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病细胞因子分泌中的作用机制

细胞因子在调节机体免疫应答的类型和程度中发挥重要作用[38]，可作为部分自身免疫性血管炎性疾病早期诊断的生物标志物，如：SLE和BD等。研究表明miRNA的异常表达可影响细胞因子或趋化因子的分泌，在免疫功能紊乱中发挥重要作用，可能与SLE、sJIA和BD的发病机制相关。miRNAs在川崎病中对细胞因子的影响尚未报道。

4.1miRNAs在SLE患者细胞因子和趋化因子分泌中的作用 IL-2降低可导致T细胞丧失对自身抗原的免疫耐受产生自身免疫。IL-2分泌减少可降低Tregs的含量、激活诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)和细胞毒活性，从而影响T细胞的功能。在SLE中MiR-200a表达下调可能增加ZEB1-CtBP2复合物与IL-2的NRE-A结合，抑制IL-2的产生miR-200a可降低IL-2的分泌。其机制可能是miR-200a降低E-box同源结合框(E-box binding homeobox,ZEB)1、ZEB2和C端结合蛋白(C-terminal binding protein,CtBP)2与IL-2沉默子A(Negative regulatory element-A,NRE-A)结合。在红斑狼疮小鼠(MRL/lpr)的CD4+T细胞中miR-200a表达下调，促进ZEB1-CtBP2复合物与IL-2的NRE-A结合降低IL-2的分泌。而在T淋巴细胞系中过表达miR-200a可出现相反的结果[39]。Amr等[40]发现，在SLE患者血清中，miR-31表达下调与IL-2的水平呈正相关，而miR-21表达上调与IL-2呈负相关。随后的研究发现miRNA-31在SLE患者T细胞中表达降低，在T细胞中RhoA可通过调节活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells,NFAT)而抑制IL-2的转录，进一步研究表明miRNA-31通过抑制其靶基因Rho A增加IL-2启动子的活性[41]。CCL5趋化因子也称受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(Regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)，能募集白细胞在炎症部位聚集，在SLE的发病机制中发挥重要的作用。miRNA-125a可直接靶向Kruppel样转录因子(Kruppel-like factor,KLF)13基因降低RANTES的表达水平。在SLE患者的T细胞中miRNA-125a表达下调，使RANTES的表达增加[42]。

4.2miRNAs在sJIA患者细胞因子分泌中的作用 IL-6在sJIA患者急性期循环血白细胞中表达显著升高，且IL-6的拮抗剂托珠单抗对sJIA患者的治疗有效[43]。Sun等[44]通过基因芯片分析和RT-qPCR验证发现miR-26a在sJIA患者血清中表达上调，且与IL-6的水平呈正相关，表明miRNA-26a可调节与sJIA患者先天性免疫应答相关的细胞因子IL-6的水平。另外，miR-19a的表达下调也可导致TNF-α和IL-6的分泌增加，且与miR-19a抑制SOCS3使JAK/STAT信号通路的信号传导增强有关[30]。

4.3miRNAs在BD患者细胞因子分泌中的作用 BD外周血单核细胞产生的TNF-α、IL-6增多。Woo等[45]通过基因芯片和qPCR发现miR-638、miR-4488在BD患者巨噬细胞中表达下调，而miR-3591-3p表达上调。而且在THP-1细胞中同时过表达miR-3591-3p和抑制miR-638、miR-4488，可使IL-6 mRNA增加，因此这些miRNAs可能与白塞病IL-6的分泌有关。其具体作用机制有待进一步研究。

5 miRNA在自身免疫及血管炎性疾病先天免疫细胞功能紊乱中的作用机制

5.1miRNAs在SLE患者先天性免疫应答中的作用 树突状细胞是先天性免疫应答的重要组成部分[46]。pDCs激活后伴随着大量I型干扰素(Interferon,IFN)的产生，在SLE的发病过程中发挥重要作用[47]。在新西兰黑/白F1杂种(New Zealand Black/White F1 hybrid,NZB/WF 1)狼疮小鼠模型骨髓来源的pDCs中，TLR7促进miR-155-Ship1信号通路的活化并增加pDCs表面CD40分子的表达[48]。干扰素调节因子(Interferon regulatory factor 5,IRF5)和STAT1是I型IFN信号通路的重要组成成分。Tang等[49]发现MiR-146a作为I型IFN信号通路的负调节因子，与SLE疾病的活动度呈负相关,并可分别靶向IRF5和STAT1基因的3′UTR在转录后水平抑制其表达。miRNA-146a还可通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)和白介素I受体相关激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)负调控固有免疫应答[50]。Smith等[51]发现在SLE患者单核细胞中miRNA-302d表达下调可增加干扰素诱导基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)的表达，如：MX1和OSA1。干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)-9是miRNA-302d的靶基因，miRNA-302d表达下调通过增加IRF9的水平而增加ISGs表达。

5.2miRNAs参与调节sJIA巨噬细胞极化过程 在全身性幼年特发性关节炎(systematic juvenile idiopathic arthritis,sJIA)患者急性期发挥促炎作用的M1型巨噬细胞和发挥抗炎作用的M2型巨噬细胞出现表型转换。研究表明miRNA-146a和miRNA-125a-5p在sJIA患者急性期单核细胞中显著高。Li等[52]在THP1巨噬细胞中过表达miRNA-146a发现其抑制M1型极化，促进M2型极化，并通过双荧光素酶报告基因检测进一步证实INHBA为miRNA-146a的靶基因。Schulert等[53]在体外实验中发现，miR-125a-5p的过表达促进THP1巨噬细胞M2型极化，表现出M2型巨噬细胞标记的CCL1、IL-1、CD136基因表达。目前的研究说明miRNA-146a和miRNA-125a-5p在体外实验中参与巨噬细胞极化，但在sJIA患者中的作用机制有待更进一步的研究。

6 microNRA在自身免疫及血管炎性疾病血管功能紊乱中的作用机制

6.1miRNAs在SLE相关的血管损伤中的作用 SLE是内皮功能障碍的已知危险因素。IFN-α负调节内皮一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)3的mRNA，从而降低一氧化氮合酶(eNOS)的表达和NO的产生，在与血管扩张受损有关的血管异常中起一定作用。miRNA-155参与INF-α对NOS3 mRNA的负调节过程，在缺乏miR-155时，INF-α对NOS3的抑制作用被解除[54]。因此miRNA在SLE中对内皮细胞的功能起重要作用。另外，抗磷脂(Antiphospholipid,APL)-IgG抗体或者抗双链DNA-IgG抗体均可抑制内皮细胞中miRNAs(miR-124a,miR-125a,miR-222,miR-125b,miR-146a,miR-155)的表达，同时调节与ECs功能紊乱相关的分子标志物即MCP-1、TF和VCAM-1分子表达上调，而eNOS分子表达下调，表明miRNAs与SLE血管功能紊乱相关[3]。

6.2miRNAs在川崎病血管损伤中的作用 血管损伤是KD发病和死亡的主要原因，虽然川崎病诱导血管损伤的原因和分子机制目前尚不清楚，但KD受损的血管壁的主要细胞事件和组织病理学变化已经清楚，即川崎病可引起血管性内皮(Endothelial cells,ECs)损伤，受损的ECs可导致血管血栓形成，并使许多血液炎症介质进入血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)，使ECs和VSMCs凋亡和细胞外基质的产生减少，最终导致动脉瘤的形成。血清中的miR-223不仅可以进入ECs,而且对ECs具有抗增殖和促凋亡作用，并与其在VSMC中的细胞功能一致[55]。内皮细胞间质转化(Endothelial-mesenchymal transition,EndoMT)涉及急性KD患者冠状动脉壁肌成纤维样细胞介导的损伤。川崎病患儿的血清抑制内皮细胞中的KLF4/miR-483轴，导致结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)增加诱导EndoMT[56]。miRNAs介导的ECs凋亡可能参与KD血管损伤。Li等[57]发现miRNA-125a-5p在KD患者血清中表达上调，并在体外实验中验证了miRNA-125a-5p可诱导人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡通过靶向MKK7调节Bax/Bcl2信号通路。Wu等[58]发现川崎病患者血清中的miRNA-186在诱导血管内皮细胞凋亡中发挥重要作用，通过靶向SMAD6 基因激活MAPK信号通路。

7 miRNA在自身免疫性血管炎性疾病诊断中的价值

研究表明，miRNAs分子可作为自身免疫及血管炎性疾病诊断的潜在生物标志物。免疫细胞或循环miRNAs表达谱可为自身免疫及血管炎性疾病的发病机制、临床诊断、预后及新的治疗方案提供线索。miRNAs在自身免疫及血管炎性疾病的研究尚处于初级阶段，且不同人种、疾病的不同阶段及实验方法的不同研究可能使miRNAs存在差异。所以，miRNAs的临床应用尚不成熟。

7.1miRNAs是SLE诊断的潜在生物标志物 Kim等[59]在韩国人群中发现，血浆hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-92a-3p和hsa-miR-223-3p在SLE患者血浆中显著上调。且hsa-miR-223-3p与口腔溃疡和狼疮抗凝物显著相关。说明hsa-miR-30e-5p，hsa-miR-92a-3p和hsa-miR-223-3p可能是SLE诊断或临床表现的新的潜在生物标志物。

7.2miRNAs是JIA早期诊断的潜在生物标志物 在JIA患者中存在许多差异表达的miRNAs，是JIA早期诊断的潜在生物标志物。Ma等[60]通过RT-qPCR检测发现与健康对照组相比，JIA患者血清中miR-16、miR-146a、miR-223表达升高，而miR-132降低。Kamiya等[61]进一步将JIA的生物标志物血沉(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)和基质金属蛋白酶3(Matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)与microRNAs进行分析，发现在全身型和多关节型JIA患者中，miR-223和miR-16的水平分别与ESR和MMP-3呈正相关，在多关节型JIA患者中miR-146a和miR-223的水平与MMP3呈正相关，表明miR-223可能是JIA的潜在生物标志物，但具体的作用机制需更进一步的研究。

7.3miRNAs是KD诊断的潜在生物标志物 Yun等[62]发现microRNA-200c和microRNA-371-5p在急性川崎病患儿血清中表达上调，可作为KD诊断的潜在生物标志物，通过生物信息学工具(TargetScan)分析其靶基因，其聚集的信号通路主要与炎症反应相关。

8 小结与展望

自发现miRNAs以来，其对先天性和适应性免疫应答的精密调节受到了广泛的关注。在自身免疫及血管炎性疾病的发病中发挥重要作用。microRNAs参与调节各种免疫细胞如：B细胞、T细胞和树突状细胞等的功能、细胞因子和趋化因子的分泌、血管功能紊乱的调节等。至今，miRNAs在大部分自身免疫性血管炎性疾病中的研究仍处于初级阶段。多种自身免疫及血管炎性疾病中存在许多差异表达的miRNAs分子，但部分miRNA的作用机制仍不清楚。随着新的生物信息学分析工具出现、高通量基因测序方法等的应用，越来越多miRNAs的靶基因及其分子作用机制将被揭示。探索miRNAs在自身免疫性血管炎性疾病发生、发展过程中的异常表达，可在分子水平上增加对该疾病的认识，为进一步探索疾病的发病机制提供线索。