抗核抗体检测试剂审评要点概述

叶朝付 董沁芳 何蕊 浙江省医疗器械审评中心 （浙江 杭州 310012）

内容提要： 抗核抗体检测试剂是指一类利用间接免疫荧光法、免疫印迹法、化学发光法等基于抗原抗体反应原理，对人体样本中的抗核抗体进行体外定性和/或半定量和/或定量检测的试剂。文章从该类试剂的相关定义、检测方法、性能要求、说明书等方面进行简要概述，期望能够为注册申请人准备注册资料提供参考。

抗核抗体（Antinuolear Antibody，ANA）传统意义上是指以细胞核作为靶抗原的自身抗体总称，随着检测技术的发展，ANA针对的靶抗原成分由细胞核扩展到整个细胞成分。临床常见于系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性硬化病、混合结缔组织病等系统性（非器官特异性）获得性免疫缺陷病。

1.检测方法

目前，国内已批准上市的ANA检测试剂分为ANA总抗体和针对靶抗原的特异性自身抗体两大类，其中，ANA针对靶抗原的特异性自身抗体检测试剂主要包括抗核抗体谱和单项特异性自身抗体。ANA总抗体检测方法主要包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法等，ANA针对靶抗原的特异性自身抗体检测方法主要包括酶联免疫吸附法、线性免疫印迹法、化学发光免疫分析法等，检测结果报告包括定性、半定量和定量。

2.类别

依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）的规定，该类产品按照Ⅱ类医疗器械进行管理。

3.参考品

在无国家参考品的前提下，申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品。

申请人应建立合理的方法，对企业内部参考品的阴阳性及浓度/滴度进行确认。浓度确认应采用国家或国际标准品进行溯源（如有）。企业内部参考品的基质应与待测样本相同。针对多项目联合检测试剂，应分别对每一个靶抗原特异性自身抗体项目进行研究。

对于间接免疫荧光法（Indirect Immuno fluorescence，IIF）检测试剂，企业内部参考品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品。其中，阳性参考品应充分考虑可报告荧光模型的验证（至少包括均质型、胞浆颗粒型、分裂期细胞着丝点型等三种荧光模型）。

4.性能评估

4.1 检测限

申请人可根据实际情况选择合理方法研究拟申报试剂的检测限：①定性/半定量检测试剂。对检测限国家参考品或生产企业提供的参考品进行检测，浓度高于检测限参考品应检出阳性，浓度低于检测限参考品应检出阴性，检测限参考品可检出阴性或阳性。②定量检测试剂。建议参照EP17-A2文件推荐的定义和设计方案，对申报产品的空白限（LoB）、检出限（LoD）以及定量限（LoQ）进行合理评估和验证。

4.2 精密度

①对于半定量/定量检测试剂，在可报告浓度范围内，至少应在接近医学决定水平（cut-off值）浓度点以及阳性水平浓度点进行精密度的评价。对于定性检测试剂，至少应选择接近cut-off值的样本进行精密度的评价。②合理的精密度评价周期，例如：为期至少20d的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。③对于采用新技术进行的试验，或需要对检测结果进行主观解释时，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。

4.3 准确度

对于定量检测的试剂，申请人可根据实际情况选择相应的方法进行研究，如：与国家/国际参考品的相对偏差、方法学比对或回收试验等方法。

4.4 阳性/阴性参考品符合率

对于定性或半定量检测的试剂，如申报产品有相应的国家参考品，则企业内部阳性/阴性参考品应参考国家参考品的项目设置。在不低于国家参考品要求的前提下，申请人可以结合实际情况设置合理的内部阳性/阴性参考品。对于没有国家参考品的产品，申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品，阳性参考品应着重考虑抗体滴度要求，阴性参考品则主要涉及对分析特异性（交叉反应）的验证情况。

4.5 特异性

①交叉反应。建议通过检测来自其他自身免疫性疾病患者的临床样本来评价试验的特异性，并在提交的申报资料中详述产品的研究设计和评价结果。②干扰物质，内源性干扰。对样本中常见的内源性干扰物质进行检测，如甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子（RF）、干扰抗体（如人抗鼠抗体，Human Anti-Mouse Antibodies，HAMA）等。建议对抗核抗体阴性、弱阳性（临界浓度）的临床样本或模拟添加样本分别进行验证。

4.6 钩状（Hook）效应

需采用高浓度自身抗体阳性血清进行梯度稀释后由低浓度至高浓度开始检测，每个梯度的稀释液重复3～5次，对钩状效应进行合理的验证。

5.产品说明书

5.1 预期用途

至少包括以下几部分内容：①试剂盒用于体外定性和/或半定量和/或定量检测人血清和/或血浆样本中的抗核抗体或针对靶抗原的特异性自身抗体。对于多项目联合检测试剂，应逐项列明所检测的具体靶抗原特异性自身抗体项目。②适用人群特征介绍：例如高危人群，临床疑似或已诊断获得性免疫缺陷病疾病的人群。③说明与预期用途相关的临床适应症及背景情况。应针对每个可报告靶抗原特异性自身抗体项目进行编写。说明相关的临床或实验室诊断方法。

5.2 检验方法局限性

综合产品的预期用途、临床背景、检测方法等信息，对可能出现的局限性进行相关说明，如：①本产品检测结果仅供临床参考，不应作为临床诊治的唯一依据，应结合患者性别、年龄、病史及其他实验室指标等信息综合考虑。②健康人群（包括孕妇、老年人等）或感染性疾病、肝脏疾病、肿瘤性疾病等多种疾病患者可能出现ANA抗体低滴度弱阳性的情况。③ANA相关抗体缺失，针对高度可溶性抗原的自身抗体（如抗SSA抗体）、针对含量极少的胞质靶抗原（如抗Jo-1抗体）等情况，甚至可能存在系统性自身免疫病患者IIF-ANA检测结果阴性，而针对靶抗原的特异性自身抗体检测结果阳性的情况。④有关假阳性结果的可能性原因分析，如某些含普鲁卡因酰胺或肼苯哒嗪的药物；或假阴性结果，如钩状效应，或由于多种抗体同时存在时，核免疫荧光染色模式的掩盖效应。

6.小结

本文基于现行法规和标准体系以及当前认知水平，结合《抗核抗体检测临床应用专家共识》和《关于ANA检测系统510（K）申报资料的建议》，对抗核抗体检测试剂的相关定义、检测方法、性能要求、说明书等方面作一概述，旨在期望能够为注册申请人准备抗核抗体检测试剂注册申报资料时提供参考。