穿心莲内酯对大鼠心肌肥厚作用的影响

李棠

【摘要】 目的：观察穿心莲内酯抗大鼠心肌肥厚的作用。方法：选取出生1～3 d的Wistar乳鼠32只，體外培养新生Wistar大鼠的心室肌细胞，于培养的第3天，换成无血清培养基继续培养24 h，然后随机分为正常对照组、PTH组（PTH 10-7 mol/L）、PTH+穿心莲内酯组（穿心莲内酯10-5 mol/L）、PTH+穿心莲内酯+MVA组（MVA 10-4 moL/L），每组8只。穿心莲内酯预先孵育1 h，PTH及MVA均孵育24 h。分析PTH对心肌细胞直径、3H-亮氨酸（Leu）掺入率、单个细胞蛋白含量、心房利钠肽（ANP）、B型利钠肽（BNP）含量的影响;分析穿心莲内酯对肥大心肌的保护作用;分析MVA对穿心莲内酯的拮抗作用;分析各组对心肌细胞K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量的影响。结果：PTH组心肌细胞直径明显大于正常对照组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯组心肌细胞直径明显小于PTH组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均低于PTH组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯+MVA组心肌细胞直径明显大于PTH+穿心莲内酯组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于PTH+穿心莲内酯组，差异均有统计学意义（P<0.05）。设正常对照组上述指标的相对表达量均为1，PTH组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均明显低于PTH组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯+MVA组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均高于PTH+穿心莲内酯组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：10-5 mol/L穿心莲内酯能有效抑制心肌细胞肥大，同时还能抑制K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达，使用MVA后能使K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达再次增加。

【关键词】 心肌细胞 心肌肥厚 穿心莲内酯

[Abstract] Objective： To observe the anti-cardiac hypertrophy effect of Andrographolide. Method： Thirty-two Wistar rats were cultured for 1-3 d. The ventricular myocyte of newborn Wistar rats were cultured in vitro. On the third day of culture， the cells were cultured for 24 h and then randomly divided into four groups， 8 rats in each group： normal control group， PTH group （PTH 10-7 mol/L）， PTH + Andrographolide group （Andrographolide 10-5 mol/L）， PTH + Andrographolide + MVA group （MVA 10-4 moL/L）. Andrographolide was pre-incubated for 1 h， PTH and MVA were incubated for 24 h. The effects of PTH on cardiac myocyte diameter， incorporation of 3H-leucine （Leu）， protein content of single cell， ANP and BNP were analyzed， the protective effect of andrographolide on hypertrophic myocardium was analyzed， the antagonistic effect of MVA on Andrographolide was analyzed， the effect of intervention factors on the expression of K-Ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in cardiomyocyte were analyzed.Result： The diameter of myocardial cells in PTH group was significantly larger than that in normal control group， the 3H-Leu incorporation rate， the content of protein in single cell， ANP and BNP in PTH group were higher than those in normal control group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the diameter of myocardial cells in PTH + Andrographolide group was significantly smaller than that in PTH group， the 3H-Leu incorporation rate， the content of protein in single cell， ANP and BNP in PTH + Andrographolide group were lower than those in PTH group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the diameter of cardiomyocyte in PTH + Andrographolide + MVA group was significantly larger than that in PTH + Andrographolide group， the 3H-Leu incorporation rate， the content of protein in single cell， ANP and BNP in PTH + Andrographolide + MVA group were all higher than those in PTH + Andrographolide group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression levels of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 were all 1， the relative expression of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 in PTH group were significantly higher than those in normal control group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the relative expression of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 in PTH + Andrographolide group was significantly lower than those in PTH group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the relative expression of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 in PTH + Andrographolide + MVA group were higher than those in PTH + Andrographolide group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： 10-5 mol/L Andrographolide can effectively inhibit cardiomyocyte hypertrophy， and can inhibit the expression of K-Ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins. The expression of K-Ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 protein were increased again after MVA.

[Key words] Cardiomyocyte Myocardial hypertrophy Andrographolide

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.36.006

甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）是一种重要的中分子尿毒症毒素，其在体内蓄积可对心血管系统造成多种损害，可引起血压升高、心血管钙化、心律失常、心肌肥厚甚至猝死等改变，是尿毒症心血管病变的主要因素之一[1]。因此，积极探索其防治措施具有重要的临床意义[2]。大量研究表明穿心莲内酯除具有降血脂作用外，还具有抑制心肌肥厚和心脏保护的功能，但其机制尚不十分清楚。本研究以新生大鼠原代培养的心室肌细胞为研究对象，以大鼠PTH1-34作为肥大诱导剂建立心肌细胞肥大模型，观察穿心莲内酯对肥大心肌细胞的影响，探讨穿心莲内酯可能的保护机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 大鼠甲状旁腺1-34（rat parathyroid hormone 1-34，rPTH1-34，美国Sigma公司）、左旋甲羟戊酸内酯（MVA，美国Sigma公司）;穿心莲内酯（大连辉瑞制药有限公司）;3H-亮氨酸（3H-Leu，北京原子能研究所）;小鸟苷酸三磷酸结合蛋白（small GTP-binding protein，Ras）K亚基（K-Ras）、细胞外信号调节激酶12（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、磷酸化（p）ERK1/2一抗（美国SantaCruz公司）;大鼠心房利钠肽（ANP）及B型利钠肽（BNP）ELISA检测试剂盒（美国SantaCruz公司，批号20081125）[3]。

1.2 心肌细胞的原代培养 取出生1～3 d的Wistar乳鼠（32只）心尖部分，冷PBS缓冲液（pH值7.4）冲洗2次，剪碎至1 mm3，0.25%胰酶37 ℃水浴消化5 min，反复消化5～6次。将收集的细胞悬液过滤后，1 000 r/min离心10 min，取沉淀以10%血清DMEM重新悬浮，进行Percoll非连续密度梯度离心，最后加入10-4 mol/L的5-溴脱氧尿核苷抑制成纤维细胞的生长。倒置显微镜下观察细胞形态和搏动，待融合成单层细胞时开始实验[4]。

1.3 分组 于培养的第3天，换成无血清培养基继续培养24 h，然后随机分为四组：正常对照组、PTH组（PTH 10-7 mol/L）、PTH+穿心莲内酯组（穿心莲内酯10-5 mol/L）、PTH+穿心莲内酯+MVA组（MVA 10-4 moL/L），各8只。穿心莲内酯预先孵育1 h，PTH与MVA均孵育24 h。

1.4 单个心肌细胞直径的测定 细胞经不同处理后，进行苏木素-伊红（HE）染色，Motic Images Advanced 3.0软件（Micro Optic Industrial Group CO.，LTD）测量经过细胞核的最小直径为心肌细胞直径，每组随机选取5个视野，每个视野计数20个细胞[5]。

1.5 观察指标 （1）分析PTH对心肌细胞直径、3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP、BNP含量的影响，其中3H-Leu掺入率检测心肌细胞蛋白合成速率，BCA法测定单个细胞蛋白含量，ELISA法检测ANP、BNP浓度的变化;（2）分析穿心莲内酯对肥大心肌的保护作用;（3）分析MVA对穿心莲内酯的拮抗作用;（4）分析各组干预因素对心肌细胞K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平的影响，均采用Western Blot方法测定。

1.6 统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞直径、3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量比较 各组心肌细胞直径、3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH组心肌细胞直径明显大于正常对照组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯组心肌细胞直径明显小于PTH组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均低于PTH组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯+MVA组心肌细胞直径明显大于PTH+穿心莲内酯组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于PTH+穿心莲内酯组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1和图1。

2.2 各组心肌细胞K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的相对表达量比较 设正常对照组上述指标的相对表达量均为1，PTH组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均明显低于PTH组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯+MVA组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均高于PTH+穿心莲内酯组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

PTH是由甲状旁腺主细胞和嗜酸细胞分泌的含有84个氨基酸的直链多肽，在调节钙平衡中发挥了重要的作用。各种原因导致的甲状旁腺功能亢进均可引起血中PTH水平的升高。研究表明，心肌细胞上存在PTH1型受体，提示心脏是PTH的靶器官之一[6]。进一步的研究发现，高水平的盯H与心肌肥厚有关，胛H能在体外诱导大鼠心室肌细胞发生肥大反应[7]。因此本实验使用PTH作为肥大诱导剂建立了心肌细胞肥大模型，旨在探索PTH致心肌肥厚的防治。心肌细胞属于终末分化细胞，不具备增殖能力，当细胞发生肥大反应时，表现为细胞体积增大、蛋白含量增加和间质增生[8]。心肌肥大时ANP和BNP代偿性增加，是公认的特征性变化指标。因此笔者在实验中以细胞直径、3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP和BNP含量作为衡量心肌细胞肥大的指标[9]。本研究结果显示，PTH组心肌细胞直径明显大于正常对照组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于正常对照組，差异均有统计学意义（P<0.05），提示心肌细胞发生了肥大反应，模型建立成功[10]。穿心莲内酯分子量最小、活性最强、不良反应最轻，因此，本实验中选用穿心莲内酯作为心肌肥厚的保护剂[11]。本研究结果显示，PTH+穿心莲内酯组心肌细胞直径明显小于PTH组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均低于PTH组，差异均有统计学意义（P<0.05），说明穿心莲内酯能有效地抑制肥大反应的发生，对肥大心肌具有保护作用。有关穿心莲内酯抑制心肌肥厚的具体机制还不十分清楚。一部分研究认为可能与其上调PPARα、γ、下调AT1和TLR4 mRNA、抑制ERK1/2的活化等有关，大多数研究则认为与其阻断甲羟戊酸通路和小GTP蛋白活性有关，最近的研究还发现穿心莲内酯通过抑制Ras-ERK途径抑制心肌肥厚[12-13]。本研究结果显示，PTH组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均明显低于PTH组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果提示心肌肥厚时Ras和ERK1/2蛋白活化，使用穿心莲内酯后Ras和ERK1/2蛋白表达减少，结合既往研究的结果：ERK1/2的活化参与了PTHH致心肌肥厚的发生，提示穿心莲内酯可能通过抑制ERK1/2的活性从而抑制心肌肥厚的发生。ERK1/2是多种信号转导途径的连接点，受多种信号的调控[14-15]。为了进一步证实Ras蛋白在穿心莲内酯抑制心肌肥厚中的作用及其与ERK1/2的调控关系，使用MVA进行干预。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶是MVA合成的限速酶，MVA通路在细胞生长过程中发挥了重要作用[16-17]。Samala等[18]证实，随着心肌肥厚的发展，膜结合的Ras含量逐渐增加，磷酸化MAPK亦增加。穿心莲内酯能减少Ras活性及膜结合含量，减少磷酸化MAPK含量，进而减少p-MHCQ403转基因家兔心肌肥厚的进程[19-20]。本实验结果显示，PTH+穿心莲内酯+MVA组心肌细胞直径明显大于PTH+穿心莲内酯组，3H-Leu掺入率、单个细胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于PTH+穿心莲内酯组，差异均有统计学意义（P<0.05）;PTH+穿心莲内酯+MVA组K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量均高于PTH+穿心莲内酯组，差异均有统计学意义（P<0.05）。说明抑制Ras能有效抑制ERK1/2蛋白的表达和心肌肥厚的发生，即穿心莲内酯可能通过抑制Ras-ERK1/2途径从而抑制了心肌肥厚反应。此外，使用MVA后没有完全对抗穿心莲内酯的抗肥大作用，提示穿心莲内酯可能还通过其他途径发挥抗肥大作用，还有待于进一步的研究。

综上所述，10-5 mol/L穿心莲内酯能有效抑制心肌细胞肥大，同时还能抑制K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达，使用MVA后能使K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达再次增加。

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（收稿日期：2019-10-31） （本文編辑：程旭然）