家兔CETP基因多态性与肉质性状的关联分析

王 杰，党树璋，罗 刚，贾先波， 陈仕毅， 赖松家*

（1.四川农业大学动物科技学院；2.四川农业大学动物遗传研究所，成都 611130）

CETP基因编码血浆胆固醇酯转移蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP），参与了胆固醇逆向转运的调节和高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）的代谢，被认为是影响人类健康长寿的重要候选基因[1]。研究表明[2-4]，猪的CETP基因位于6号染色体，在脂肪代谢转运蛋白中具有重要作用，被认为是影响动物体脂沉积、生产性能的候选基因。据联合国粮农组织调查，兔肉在欧洲许多国家，如意大利、捷克、西班牙、比利时、卢森堡、葡萄牙、法国，还有一些北非国家（埃及、阿尔及利亚）受到消费者的青睐，兔肉生产在国民经济中发挥着重要作用[5-6]。兔肉能提供丰富的营养物质，首先蛋白含量很高，尤其是限制性氨基酸水平较高。家兔背最长肌和后腿的蛋白含量高达22%。同时矿物质、维生素、抗氧化因子含量高，而兔肉胆固醇和脂肪含量低，被认为是消费者首选的功能性食品[5]。但是，家兔育种，尤其是我国的肉质育种方向研究滞后，国外优良的家兔配套系在我国未得到大面积推广，国内也未见培育效果好的配套系，家兔的分子育种研究少之又少[7]。迄今为止，未见CETP基因在家兔育种方面的研究报道。为此，本研究以3个家兔品种为材料，采用PCR产物直接测序技术，探讨CETP基因对家兔肉质性状的影响，以期为家兔肉质早期育种提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验356份兔耳组织样品（伊拉兔124只，香槟兔143只，天府黑兔89只）采集于四川农业大学家兔实验场，并于-70℃冰箱保存备用。本实验家兔在70日龄屠宰，耳组织样品按试剂盒（Axygen，USA）提供的方法提取全基因组DNA，并将其保存于-20℃冰箱，实验所用家兔背最长肌和后腿肌样品保存于4℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 肉质性状测定的方法

家兔屠宰率按常规方法计算。pH值测定采用pH仪（Model PH-STAR CPU，MeisterR，Germany）完成，测定探针深入肌肉3cm；肉色测定采用R.L.Van Laack等报道的比色体系[8]，数据由亮度（L*），红度（a*）和黄度（b*）组成。pH和肉色测定两次，分别为刚屠宰的肉和屠宰后24 h的肉。肌内脂肪（intermucal fat，IMF）采用矫正的Soxhlet方法[9]测定刚屠宰的肌肉。

1.2.2 PCR 与测序

根据Ensembl报道的家兔CETP基因序列NO.ENSOCUG00000013137采用Premier 5软件设计一对引物：CETP-F：TCCACTTGTTCCCTCAGCCTC 和CETP-R：CAGCGGCTGTGTACTCACTCG。PCR反应采用25 μL反应体系：50 ng全基因组DNA，上下游引物各 1 μmol/L，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs（dATP，dTTP，dCTP 和 dGTP），0.4 个单位的 Taq DNA聚合酶（MBI），2.5 μL 的 100×buffer。PCR 扩增程序：95℃预变性 5 min；40个循环，94℃ 45 s，56℃ 45 s；72℃ 40 s；最后72℃延长10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。扩增效果良好的PCR产物送上海英骏生物技术有限公司纯化测序。

1.3 数据分析

1.3.1 基因多态性分析

采用DNAstar软件进行序列对比判断突变位点及其基因型，并进一步计算得到基因型和基因型频率。利用POPGENE软件测试哈温平衡的χ2值。多态信息含量（PIC）通过下列公式计算得到。PIC＞0.5为高度多态；0.25＜PIC＜0.5 为中度多态；PIC＜0.25 为低度多态。

1.3.2 基因型与家兔屠体性状关联分析

本实验数据采用 SPSS 21（IBM，Armonk，NY，USA）中一般线性模型（GLM）进行关联分析，分析的线性模型为：Yijk=μ+Gi+Sj+eijk，Yijk为个体性状观测值，μ为个体性状均值，Gi为基因型效应，Sj为个体性别效应，eijk为随机误差效应。数据计算方式均采用最小二乘法和标准误，并用Bonferroni T检验。

2 结果与分析

2.1 家兔CETP基因多态性

实验结果发现，在CETP基因的第4外显子的第11 bp处发生了单核苷酸变异，产生3种基因型为AA、GG和AG，见图1。3个家兔群体的基因多态性分析结果，见表1。由表1可以看出，GG为优势基因型，G为优势基因。最小等位基因频率变化范围为：0.363 6～0.421 3，表示该突变位点较多态。多态信息含量PIC结果显示，本研究的3个家兔群体均处于中度多态，能表现出明显的群体特征。而且χ2检测结果显示家兔群体偏离哈温平衡，表示3个家兔群体均未达到遗传平衡的状态。

图1 家兔CETP基因型测序图谱Figure 1 Sequencing map of three genotypes of the rabbit CETP gene

2.2 家兔CETP基因多态与屠体性状的关联分析

3个家兔群体不同基因型与屠宰率的相关分析结果，见表2。可以看出，不同基因型家兔全净膛屠宰率差异不显著（P＞0.05），但 GG 和 AG 基因型的全净膛屠宰率数值高于AA基因型。GG基因型家兔的半净膛屠宰率最高，与AA和AG基因型差异显著（P＜0.05）。

不同基因型与家兔背最长肌肉质性状的相关分析结果，见表3。可以看出，AA基因型的新鲜兔肉的红度最高，与GG和AG基因型的红度差异显著（P＜0.05）。而且，AA 基因型的 24 h 肉的红度也最高，与 AG 基因型差异不明显（P＞0.05），但与 GG 基因型差异显著（P＜0.05）。AG基因型的兔背最长肌肌内脂肪含量最高，而且与AA基因型差异显著（P＜0.05）。

表3 家兔CETP基因多态性与背最长肌肉质性状的相关分析Table 3 Association between SNP of CETP gene and meat traits in rabbit longissimus dorsi muscle

不同基因型与家兔后腿肌肉质性状的相关分析结果，见表4。可以看出，AG基因型新鲜兔肉亮度最大，与 AA、GG 基因型亮度差异显著（P＜0.05）。AA基因型24 h兔肉红度最大，与GG和AG基因型差异显著（P＜0.05）。AA基因型的家兔后腿肌内脂肪含量最高，与 AG 基因型差异显著（P＜0.05），但与 GG基因型差异不显著（P＞0.05）。

表4 家兔CETP基因多态性与后腿肌肉质性状的相关分析Table 4 Association between SNP of CETP gene and meat traits in rabbit biceps femoris muscle

3 讨论

由实验结果可以看出，家兔CETP基因的3种基因型明显影响了屠宰率。无论是全净膛屠宰率还是半净膛屠宰率，GG基因型的数值都是最高的。说明了GG基因型可有效提高家兔的屠宰率，G等位基因可能具有提高屠宰率的作用。pH值、肉色和肌内脂肪是衡量肉质最重要的标准。无论是新鲜的还是储存24 h的背最长肌和后腿肌，其pH值不受核苷酸变异的影响（P＞0.05），但储存 24 h 的肉，pH 值均会下降，这与F.Hulot和J.Ouhayoun研究结果[10]一致，家兔刚屠宰时兔肉pH值接近中性，但屠宰后会迅速下降。而且，C.P.Zeferino等[11]发现储存24小时和48小时的兔肉pH值没有显著变化。肉色研究结果与 G.A.María 等[12]的研究一致，本研究只是发现CETP基因显著影响了家兔的两个时间的背最长肌红度（P＜0.05），且 AA 基因型红度最大，AG 型次之，GG型最小。CETP基因只对后腿肌的L*0h和a*24h有显著影响（P＜0.05）。与猪肉相比，无论是背最长肌还是后腿肌的肌内脂肪都是最低的[13]，本研究发现CETP基因变异对家兔背最长肌和后腿肌的肌内脂肪均有显著影响（P＜0.05），值得一提的是，家兔背最长肌AG基因型肌内脂肪数值最高，与AA基因型差异显著（P＜0.05），后腿肌却相反，AA 基因型肌内脂肪数值最高，与AG基因型差异显著（P＜0.05），其原因有待于进一步深入研究。

4 结论

本研究发现CETP基因第4外显子第11 bp处有3个基因型，且G为优势等位基因。该变异位点显著影响了家兔半净膛屠宰率，背最长肌的红度。同时，该变异位点显著影响了家兔背最长肌和后腿肌的肌内脂肪含量。由此可以推测，CETP基因可能是影响家兔肉质性状育种的候选基因。