显微镜计数法测定浮游植物的研究进展及修订建议

铁 程，张榆霞，金 玉，赵琦琳，施 择，李爱军，李 颖

云南省环境监测中心站,云南 昆明 650034

浮游植物一般指浮游藻类，是悬浮于水中生活的微小藻类植物[1]。浮游植物的种类组成特点和数量的变化，能敏感地反映复杂的环境因子变动[2-3]。武汉东湖30年来浮游植物的演变规律以及国内许多同类调查研究都证明：湖泊(水库)浮游植物数量的增加，特别是蓝藻丰长和生长季节的延长是湖泊富营养化的一个重要标志[4]。因此，浮游植物群落结构特征和时空变化是水环境监测、水质评价、水环境污染研究、水体生态修复和治理的重要内容[4-8]。

显微镜计数法是淡水浮游植物测定最常用的经典方法，不仅可以测定浮游植物生物量，还可以进行浮游植物的种类及群落结构分析[9]。国内开展显微镜计数法测定浮游植物密度的主要依据有《内陆水域浮游植物监测技术规程》(SL 733—2016)、《水和废水监测分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富营养化调查规范(第二版)》[11]以及《湖泊生态调查观测与分析》[1]等规范和文献。美国、英国和欧盟等国家和地区也制定了相关标准和规范。如英国的WaterQuality-GuidanceStandardontheEnumerationofPhytoplanktonUsingInvertedMicroscopy(BS/EN 15204∶2006)[12]对浮游藻类样品的保存、准备、计数、质量保证、不确定度的评估等方面进行了全面细致的规定。美国的StandardClassificationforSamplingPhytoplanktoninSurfaceWaters(D4149-1982)[13]规定了采集浮游藻类的常用技术和工具；StandardTestMethodforAnalysisofPhytoplanktoninSurfaceWaterbytheSedgwick-RafterMethod(D4148-1982)[14]对样品的保存、前处理、藻细胞密度的测定过程、精密度和偏差的计算方法进行了规定。StandardPracticeforPreservingPhytoplanktonSamples(D4137-1982)[15]对浮游植物样品保存试剂、条件和期限进行了规定。英国的WaterQuality-EnumerationofMicro-OrganismsinWaterSamples-GuidanceofVariationofResultwithParticularReferencetotheContributionofUncertaintyofMeasurement(BS 8496∶2007)[16]给出了在水生微生物定量分析中，测量不确定度对测定结果误差贡献的评估方法，并分析了实际案例。

国外相关标准中有一些方法和技术值得中国研究者学习借鉴，经验证、转化后能够用于完善中国相关规范，更好地指导中国淡水浮游植物的测定。

1 国外相关分析标准

美国、英国和欧盟等国家和地区的标准在结构上有较大的区别。美国材料与试验协会(ASTM)按采集、保存、分析将测定过程分为3个主要部分，用8个标准分别进行了规定。英国的BS/EN 15204∶2006标准[12]涵盖了测定的全过程，并用BS 8496∶2007标准[16]规定了测量不确定度对测定结果误差贡献的评估方法。为便于介绍，按测定过程的主要环节(采样工具、样品保存、样品前处理、样品浓缩、计数对象、浮游植物在计数框中的分布、计数方式、适宜测定的密度、计数量与精密度、检出限)对美国、英国和欧盟等国家和地区相关标准(表1)进行介绍。

表1 国外浮游植物测定标准Table 1 List of foreign methods about the enumeration of phytoplankton

1.1 采样工具

美国的D4149-1982标准[13]规定了采集浮游藻类的常用技术。定性样品的采集常用浮游生物网和泵。定量样品的采集常用Clarke-Bumpus浮游植物采样器、Juday浮游植物阱和采水瓶。使用者结合研究需要、采样区情况和浮游藻类的天然特性选择适合的工具和技术。针对每种采样工具，分别制定了5个规程[17-21]。

泵、Clarke-Bumpus浮游植物采样器和Juday浮游植物阱在国内较不常用，是一种用泵吸取所需深度的水样，用网来富集浮游藻类的半定量采样装置，通过流量计测定进入采样器水样的体积实现半定量。采水瓶与国内常用的有机玻璃采水器类似。

1.2 样品的保存

英国的BS/EN 15204∶2006标准[12]规定定性样品不加保护剂，4～10 ℃暗处保存，36 h内完成分析；定量样本加入鲁哥氏液，使其在样品中的浓度达到5%，常温暗处保存3个星期，1～5 ℃保存1年。若保存时间要超过1年，则需要加入37%的福尔马林溶液，使其在样品中的浓度达到4%。美国的D4137-1982标准[15]规定了相同的保护剂，但对定性样品的保存环境和保存时间要求更严格。

1.3 样品的前处理

BS/EN 15204∶2006[12]非常重视样品的混匀，将混匀视为对检测结果有重大影响的步骤。该标准指出：为了统一不同测定人员的混匀操作，应该对混匀的方式、时间和力度等进行详细描述和规定。多次水平摇动并结合上下颠倒样品瓶的方式对样品的混匀效果好于单一方向的摇动。摇动的力量不易过大，否则可能导致气泡产生和群体的解离。该标准还提及：为了便于细胞计数，可以用超声波震荡仪对群体形式的浮游植物进行处理，以促进群体细胞的解离，但同时要注意避免过度处理造成浮游植物细胞破损。

1.4 样品的浓缩

D4148-1982标准[14]指出：依据镜检结果和分析人员的经验决定是否需要对样品进行浓缩或稀释处理。浓缩方式为量筒沉淀法。根据量筒中水样的高度，按照4 h/cm计算沉淀时间。该标准还提及了一种称重方法：称取1 g左右的水样于容器中，并记录准确的称重结果，待水样中的浮游藻类充分沉淀后，移去大部分上层水样，再进行称重。用2次称重结果计算浓缩倍数。

BS/EN 15204∶2006标准[12]指出：浓缩水样中的浮游藻类比较耗时，且会引入误差，因此，应当尽量避免浓缩处理。可以采用沉淀、离心或过滤的方式进行浓缩。沉淀是最常用的浓缩方式。加入到沉淀器中水样的高度不能超过沉淀器直径的5倍。

1.5 计数对象

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater标准[22]未明确规定计数对象为细胞还是群体，而是指出以细胞为对象，计数结果较为准确，但比较费时；以群体为计数对象则较为方便，但计数结果较不准确。使用者可根据自己的需求和实际情况进行选择，并在结果报告中说明。

BS/EN 15204∶2006标准[12]将情况分为3种：①当群体中的浮游植物细胞个体较易被辨识时，可将细胞作为计数对象；②当同种浮游植物群体中所含细胞数量稳定时，可将群体作为计数对象，用群体数乘以群体中平均细胞数；③当不具备上述2个条件时，采用超声波震荡或水解方式离散群体中的细胞，然后以细胞为对象计数。

1.6 浮游植物在计数框中的分布

BS/EN 15204∶2006标准[12]认为浮游植物随机分布于计数框中是按标准开展测定、估计测定误差的前提，并提出了一些保障措施：在计数之前，应在低倍数下，对整个计数框进行观察，以确认浮游藻类是否为随机分布；低温保存过的样品，需要将其放置至室温后，再加入计数框中；如果样品的温度低于计数框，通常较大、较重的浮游植物会倾向分布于计数框的周边，较小的浮游植物倾向分布于计数框的中央。

1.7 计数方式

BS/EN 15204∶2006标准[12]中提出了3种计数方式：随机视野法、行条法和全片法，并指出随机视野法能够在工作量相对不大的情况下，给出相对最准确的结果。因为行条法只观察了计数框的中间部分，如果浮游植物在计数框中的分布不均匀会影响结果的准确性，而随机视野法能够克服这个问题。

D4148-1982标准[14]中提出了2种计数方式和适用范围：行条法适用于藻细胞密度较低的水样、视野法适用于藻细胞密度较高的水样。

1.8 最佳检测范围

BS/EN 15204∶2006标准[12]对适宜测定的浮游植物密度提出了定性要求：测试的水样应满足藻细胞之间、藻细胞与颗粒杂质之间不相互粘合或堆叠；过低的藻密度将导致大的随机误差；过高的藻密度将会导致观察困难、耗时和测定人员的疲劳。

1.9 计数量与精密度

BS/EN 15204∶2006标准[12]提出：浮游藻类的计数量由测定所需的精度决定。在日常分析工作中，应事先设定精度，精度可以由标准偏差、相对标准偏差、95%相对置信区间等表示，并且给出了相对标准偏差与计数量的关系式：

(1)

如将精密度(以相对标准偏差表示)设定为5%，则应该至少计数400个浮游藻类。

如果精密度由置信区间表示，则用公式(2)计算：

(2)

如当浮游藻类计数量为400个时，95%置信区间为测定结果±10%。

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater标准[22]中给出了与公式(2)类似的计算方法。2个国外标准均指出：浮游植物随机分布于计数框中，是准确估计最少计数量或精密度的前提和保障。

1.10检出限

BS/EN 15204∶2006标准[12]认为检出限是浮游植物测定方法的重要性能指标。对于随机分布于计数框中的单种藻类，检出限可由泊松统计模型得到。

(3)

式中:α为显著水平；ndet为检出限；ftotal为计数框的总视野数；fcounted为被计数的视野数。

2 国内相关规范

《内陆水域浮游植物监测技术规程》(SL 733—2016)、《水和废水监测分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富营养化调查规范(第二版)》[11]、《湖泊生态调查观测与分析》[1]等是国内显微镜计数法测定浮游植物密度的重要标准和规范性文献。在样品的采集、保存和浓缩方面，它们均采用了25号浮游生物网采集定性样品；用有机玻璃采水器采集定量样品；用鲁哥试剂或福尔马林试剂保存定量样品；用沉淀法和虹吸法浓缩水样中的浮游植物。样品的测定方面，它们均采用了中国通用的面积为20 mm×20 mm、容量为0.1 mL的浮游植物计数框，框内划分横竖各10行、10列，共100个小方格。计数方式主要有全片法、行格法、视野法和对角线法。观察和计数全部100个小格的全片法较耗时耗力，一般较多采用观察计数框中的一部分区域的方法(如观察藻类计数框中第2、5、8行，共30个小方格的行格法，观察一定数量的显微镜可见区域的视野法，只观察位于计数框对角线位置上的10个小方格的对角线法等)。质量控制方面，它们均规定“不大于±15%”，但对误差的描述有所不同，分别为“两片计数结果个数相差”“每次计数的结果与其平均值之差”和“相对偏差”。

3 国内规范中的不足

3.1 国内规范未对浮游植物在计数框中的分布提出要求

BS/EN 15204∶2006标准[12]很重视浮游植物在计数框中的分布，认为浮游植物随机分布是准确测定和估计测量不确定度的前提。

对于仅观察计数框中部分区域的计数方式，浮游植物在计数框中的分布对测定的精密度有较大影响。笔者分析了3家实验室用对角线法重复测定洱海、抚仙湖和滇池水样的结果(表2)。经统计分析发现，浮游植物在计数框中越符合泊松分布，重复测定结果的一致性越好。

《内陆水域浮游植物监测技术规程》(SL 733—2016)、《水和废水监测分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富营养化调查规范(第二版)》[11]和《湖泊生态调查观测与分析》[1]等标准和规范性文献没有对浮游植物在计数框中的分布提出要求，也没有给出促使浮游植物随机分布于计数框中的有关措施。

3.2 国内规范未对设定最少计数量进行说明

BS/EN 15204∶2006标准[12]提出由测定所需的精密度决定浮游植物的计数量，并给出了两者的定量关系式。在开始测定前应先设定测定需达到的精度要求，然后根据定量关系式算出测定中所需的最少计数量。StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater标准[22]中提出可根据浮游植物的计数量估计测定结果的置信区间，相反也能够根据测定误差的要求，计算所需的最少计数量。

笔者分别应用对角线法、行格法和全片法对稀释10倍、原水和浓缩10倍的洱海水样进行了重复(7次)测定。通过统计平均计数量、平均观察到的浮游植物种类数和重复测定结果的相对标准偏差(表3)发现：①随计数量的增加，观察到的浮游植物种类越多(图1);②随计数量的增加，重复测定结果越一致(图2);③根据拟合方程的测算，当浮游植物最少计数量不少于1 200个时，相对标准偏差能达到小于15%的要求。牛海玉等采集了3座不同营养水平的水库及3组不同处理的实验围隔样品，对每个样品进行了重复测定，同样发现随计数量的增加，浮游植物丰度偏差减小，并且随计数量增加镜检到的浮游植物种类数增加[23]。

表2 3家实验室重复测定结果及统计分析结果Table 2 Repeated measurement results and statistical analysis results in three laboratories

表3 重复测定结果统计Table 3 Statistical results of repeated determination

图1 浮游植物细胞计数量与观察到的浮游植物种类的关系Fig.1 Relationship between phytoplankton counts and observed phytoplankton species

图2 浮游植物细胞计数量与重复测定结果一致性的关系Fig.2 Relationship between phytoplankton counts and the consistency of repeated measurements

《水和废水监测分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富营养化调查规范(第二版)》[11]和《湖泊生态调查观测与分析》[1]中未明确最少计数量的要求。《内陆水域浮游植物监测技术规程》(SL 733—2016)规定了计数量宜为500～1 500个，但表述过于简单，未明确将计数量与精密度联系起来，不便于测定人员根据测定要求设定合理的计数量。

3.3 国内规范未给出检出限的确定方法

《内陆水域浮游植物监测技术规程》(SL 733—2016)、《水和废水监测分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富营养化调查规范(第二版)》[11]和《湖泊生态调查观测与分析》[1]中没有给出显微镜计数法的检出限，也没有给出确定检出限的方法。虽然《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)中给出了确定检出限的方法，但显微镜计数法与化学分析方法有较大区别，难以直接应用该导则中的方法确定其检出限。

BS/EN 15204∶2006标准[12]提出了关于浮游植物的测定——显微镜计数法的检出限定义:对于单种藻类，在单次计数过程中，发现它的概率不低于某个规定要求时，该藻类在水样中的密度即为检出限，并应用泊松分布模型计算满足检出限定义的藻密度。

借鉴BS/EN 15204∶2006标准[12]的定义和计算方法，将显微镜计数法的检出限定义为对于单种藻类，在单次计数过程中，发现它的概率不低于99%时，最低的藻密度即为检出限。以泊松分布模型为基础，对国内规范中的对角线计数、行格计数、全片计数和随机视野计数的检出限进行计算。泊松分布模型计算公式为

(4)

式中：P(x)为连续观察n个计数格，每个计数格出现x个藻细胞的概率；λ为单个计数格中浮游植物细胞平均数量，个；x为预计单个计数格中浮游植物细胞的数量，个；n为观察的计数格数，个。

为结合实际测定过程，将上述检出限的定义适当转化为对于单种浮游植物，连续观察计数框中的n个计数格后，未发现它的概率为1%时，所对应的水样中该种类浮游植物的细胞密度。根据定义可知：P(x)=1%、x=0，求λ。带入式(4)得到式(5)：

(5)

式中：λ为单个计数格中浮游植物细胞平均数量，个；n为观察的计数格数，个。

再将λ的计算结果带入式(6)，即可得出检出限。

DL=Nλ/v

(6)

式中：DL为检出限，个/L；N为计数框中计数格的总数，个；v为加入计数框中的水样的体积，L。

对角线计数、行格计数检出限的计算：已知N=100个，v=0.000 1 L，对角线计数、行格计数观察的计数格分别为n=10、n=30个，将已知参数代入式(4)、式(5)可算得对角线计数、行格计数的检出限分别为DL=4.6×105个/L，DL=1.5×105个/L。

全片计数检出限的计算：当对整个计数框中全部100个计数格逐一观察计数时，如果观察过程十分细致，计数框中仅有1个浮游植物细胞也能够被检出。因此，全片计数法决定检出限的环节是从样品中吸取0.1 mL水样装入计数框时，吸取到0个藻细胞的概率为1%时，样品中藻细胞的密度。因此需将式(4)、式(5)中各参数的意义调整为P(x)为0.1 mL水样中含有x个藻细胞时的概率；λ为0.1 mL中含有藻细胞的平均数量，个；x为预计0.1 mL水样中含有藻细胞的数量，个；n为从水样中取样的次数。

将式(6)改为式(7)：

DL=λ/v

(7)

式中：DL为检出限，个/L；v为吸取水样的体积，L。

已知：P(x)=1%，x=0个，n=1次，v=0.000 1 L，代入式(5)、式(6)后求得λ=4.6个、全片计数法的DL=4.6×104个/L。

随机视野检出限的计算：由于检出限与观察的视野数、视野面积和计数框面积有关，根据式(8)、式(9)计算：

(8)

(9)

式中：λ为单个视野中浮游植物细胞平均数量，个;n为随机视野数，个；DL为检出限，个/L；S为计数框的面积，cm2；s为一个视野的面积，μm2；v表示加入计数框中的水样的体积，L。

如已知计数框的面积为S=4 cm2。显微镜放大倍数为400倍时，经校准得知1个视野的面积为s=90 716.8 μm2。在观察了n=300个视野的条件下，经计算随机视野的DL=6.8×105个/L。

表4 4种计数方式的检出限Table 4 Detection limits of 4 kinds of counting pattern

注：随机视野方式的检出限与观察的视野数、视野面积和计数框面积有关，应根据具体测定条件进行计算。

4 完善国内规范的建议

4.1 对浮游植物在计数框中的分布提出要求

浮游植物随机分布于计数框中是提高测定精密度，准确估计测定误差和确定检出限的保障。因此，在相关规范中应提出“在开始显微镜计数前，应先确认浮游植物随机分布于计数框中”的要求，并提出一些保障措施(如应在开始计数前在显微镜的低放大倍数下，对浮游植物在计数框中的分布进行确认，当满足随机分布时才开始计数；经低温保存的样品，在向计数框中加注水样前，应将样品在室温下放置足够长的时间，使水样与计数框的温度相同)。

4.2 对浮游植物的最少计数量提出要求

一般来说，测定中对浮游植物的计数量越多，重复测定结果间的一致性越好，同时观察到的浮游植物种类数也越多。但一味增加计数量会造成测定时间的延长，会导致计数框中样品的过量蒸发和空气的进入，反而严重影响测定的准确性。因此在相关规范中应结合测定精度的要求，提出恰当的计数量，使测定方案一方面满足精度要求，尽量减少遗漏的浮游植物种类，另一方面使工作量在可接受范围内。

BS/EN 15204∶2006标准[12]中提出的：由测定所需的精度决定浮游植物的计数量(并给出了两者的定量关系式)，为如何确定最少计数量提供了参考依据，值得国内相关研究人员参考和借鉴。

4.3 给出检出限的确定方法

检出限是分析方法重要的性能指标之一，在《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)中规定，检出限是环境监测分析方法的必备要素，在相关规范中应给出显微镜计数法的检出限或检出限的确定方法，但该导则中给出的确定检出限的方法不适用于显微镜计数法。

BS/EN 15204∶2006标准[12]将显微镜计数法的检出限定义为在测定过程中发现某种浮游植物的概率不低于某个要求时，该种浮游植物在水样中的密度，并应用统计学方法计算出符合定义要求的浮游植物的密度。这种确定显微镜计数法检出限的方法值得国内相关研究人员参考和借鉴。