新型3D打印PLCL/Col多孔复合支架的制备及初步表征*

刘威 王猛 蔡高锐 刘黎军 熊建义** 王大平**

（1.深圳市第二人民医院创伤骨科，广东深圳518035；2.深圳市组织工程重点实验室，广东深圳518035；3.驻马店市第一人民医院骨科，河南驻马店463000）

支架作为组织工程三要素之一，在组织再生过程中发挥重要作用。制备理想的组织工程支架用于修复组织缺损、促进组织再生是当前研究热点之一。现有的支架成型技术的类型较多，且各有优缺点，其中三维打印技术包括低温快速成型技术（lowtemperature deposition manufacturing,LDM），LDM因其有能精确控制支架孔径尺寸和孔隙率的优势，越来越多地应用于组织工程领域[1-3]。LDM是基于快速成型技术原理，结合相分离法的一种新型快速成型技术，属于绿色制造的范围。它与其他快速成型技术不同之处在于其成型腔内温度被控制在0℃以下，喷头喷出的溶液在低温下快速凝结，并且喷头在计算机控制下按程序运动，打印层通过层层叠加最终使支架成型为三维立体结构，最后，冻结的支架经过冷冻干燥去除溶剂后成型为三维多孔支架[3]。

聚左旋乳酸(poly L lactic acid,PLLA)、壳聚糖、I型胶原蛋白（collagen type I,Col）等已成功打印[4-6]。然而，复合材料的打印通常是将合成材料与无机纳米颗粒混合后打印实现，如郑雄飞等[5]以水为溶剂把壳聚糖与纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA）混合后，用LDM打印成三维复合材料支架。尽管如此，现有技术打印的三维支架仍然存在各自缺陷，合成材料如乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lacticco-glycolic acid,PLGA）与无机纳米颗粒如nHA混合后虽然力学性能得以保持，并且能改善支架的亲水性，但是其生物相容性却相对天然高分子材料支架较差；天然材料如壳聚糖与无机纳米颗粒如nHA复合支架生物相容性较好，但其力学性能大不如合成材料支架[3,7,8]。所以，如何能在保持力学性能良好的情况下获得较好的生物相容性，是利用LDM打印三维多孔组织工程支架亟待解决的问题。

合成材料如左旋乳酸-己内酯共聚物（poly L lactide-co-ε-caprolactone，PLCL）具有较好的力学性能，天然高分子材料如Col具有较好的生物相容性。所以，理论上解决上述问题的方法之一就是实现合成材料与天然高分子材料的复合。有研究者尝试采用在合成材料支架表面涂覆的方法或者天然材料填充合成材料支架的方法解决问题，取得了一定效果，但是由于各类材料的相与相之间不均一，未能实现合成材料与天然高分子材料的均一复合[8-10]。由于LDM对溶解材料的溶剂要求较为苛刻，要求溶剂在常温下为能够溶解材料的液态，而在溶液从喷嘴打印出，能很快转变为冻结状态，以保证支架成型[11]。因此，溶解材料的溶剂成为制约合成材料与天然高分子材料的均一复合的瓶颈。当前，利用LDM打印时，所选择溶解材料的溶剂绝大多数情况下为1,4-二氧六环（1,4-dioxane，DIO），较少数情况下选择水，然而DIO和水都难以同时溶解合成材料和天然高分子材料[7,12,13]。有鉴于此，有必要找寻新的方法，解决合成材料与天然高分子材料的均一复合问题，以使所打印支架同时具有良好力学性能和生物相容性，拓宽LDM所处理材料的范围，扩展其应用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

PLCL购买自济南岱罡生物工程有限公司，IV:2.5 dl/g；Col从猪皮中提取，购买于四川铭让生物科技有限公司，分子量为300 kDa。DIO购买自上海凌峰化学试剂有限公司；六氟异丙醇（hexafluoroisopropanol,HFIP）购买自上海达瑞精细化学品有限公司。

1.2 溶液配制

以配制10 ml，溶剂HFIP比例为10%，Col含量为0.1 g的PLCL和Col混合溶液为例。取1 ml浓度为10%的HFIP Col溶液滴入9 ml DIO溶剂中，搅拌48 h后，称量1.3 g PLCL加入过滤后的Col DIO/HFIP溶液，溶解并搅拌48 h直至PLCL完全溶解并和Col充分混合后备用。称量1.3 g PLCL溶入10 ml DIO溶剂中，然后搅拌48 h后，配制成PLCL溶液。本实验所配置溶液及详细数据如表1所示。

1.3 PLCLL//Col支架制备

利用低温快速成型系统(Tissue Form II,清华大学)的Cark软件，设计支架的打印参数。依次连接料罐、送料管、喷头，将溶液倒入料罐内，冰箱制冷，准备成型。待成型室温度降至-25℃～-35℃左右，启动温控、数控，在软件控制下，喷嘴软件设置的运动轨迹及造型参数在X、Y轴上进行扫描并挤压喷出溶液，溶液在成型室内的低温下，迅速凝固。当第一层打印结束，成型平台在Z轴上下降一定高度，喷嘴继续进行打印新的一层，层层叠加形成一个三维冻结支架。成型后处于冻结状态的支架迅速取出后放置进冷冻干燥机中72 h，去除有机溶剂，使三维多孔支架最终成型。支架规格为23.6×23.6×23.6 mm3，成型温度在-30℃左右，喷嘴直径0.6 mm，喷丝间距0.8 mm，扫描速度22 mm/s，喷头速度1.0～2.0 mm/s。

1.4 支架形貌表征及孔径测量

用Canon EOS 5D Mark III光学相机对支架拍照，进行大体观察。将PLCL/Col试样分别剪切成一定尺寸小方块，用溅射仪喷金40～60 s，然后在10～15 kV的加速电压下用型号S-450扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察三维多孔支架形貌及孔隙结构。根据SEM图像用Image J（National Institutes of Health,USA）测量支架孔径尺寸及打印线条直径。

1.5 支架孔隙率检测

采用液体取代法测定支架孔隙率。先将PLCL切成数个小长方体（n=5），测量其体积V1，再将支架置入盛有体积为V2的乙醇的量筒中，抽真空至支架不再冒出气泡，测量此时量筒读数为V3，则支架的孔隙率ρ(%)=(V1+V2-V3)/V1×100%。同法测量PLCL/Col复合支架的孔隙率。

表1 配置溶液中溶剂和溶质含量比例（以10 ml溶液为例）

1.6 支架的收缩率检测

用直尺测量成型支架的高、长和宽的尺寸，然后与设定参数比较，分别计算支架的高、长和宽的收缩率，每组样品数量为4个。

1.7 支架红外光谱测试

将样品用型号为VERTEX 70的红外光谱仪对其进行红外光谱仪测试分析；分辨率为4 cm-1，扫描时间为16 s，测试波长范围在600～4000 cm-1。

1.8 支架力学性能观测

对支架的侧面进行挤压和对垂直面进行按压，观测支架的力学性能和回弹能力。用Canon EOS 5D Mark III光学相机进行拍照，记录观测过程。挤压时间和按压时间均为10 s。

1.9 统计学方法

采用Origin 9(Origin Lab Lnc,USA)软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示；组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支架打印

常温下，支架取出后一段时间内能够保持完整的结构和形态，不会快速的融化。由于支架内DIO冻结，支架呈现乳白色；支架的孔隙规则，结构清晰（图1）。实验过程中发现过高比例的HFIP不利于支架的成型。当HFIP的体积比例超过15%时，在成型腔内成型的冻结支架取出后会迅速融化，导致冷冻干燥步骤难以进行。这是由于HFIP在-30℃左右难以冻结，而在常温下会迅速挥发。所以本实验中，HFIP的比例控制在10%以下，以保证支架的成型。

2.2 支架外观和收缩率

冷冻干燥后最终成型的PLCL/Col和PLCL支架，从垂直面均能观察到支架上打印线条呈连续状态，未出现断丝等现象。此外，3种支架均呈现较清晰的孔隙和规则的孔隙结构。从侧面观察，支架呈现良好的三维立体结构，和计算机软件设计的模型形态一致。PLCL/Col-10支架有些许变形（图2A1）。这可能是两个原因导致。一是支架材料中含有合成弹性材料PLCL，其加工成支架后由于本身材料学性能，会导致支架收缩；二是受HFIP溶剂的影响，由于其没有被冻结，易挥发，所以支架在成型腔成型至冷冻干燥成型过程中，会导致支架的结构受到影响，导致其最终变形。

图1 成型后的冻结PLCL/Col复合支架光镜图

各支架的高、长和宽的收缩率都在20%左右。其中PLCL支架的宽和高的收缩率与其他组相比都是最高。表2的数据进一步显示，PLCL/Col-5支架的高的收缩率较其他组低，而PLCL/Col-10的长和宽的收缩率较其他组低。上述结果表明胶原蛋白的加入有利于降低支架的收缩率。

2.3 支架微观形貌和孔径检测

图2 冷冻干燥后最终成型的PLCL/Col和PLCL支架光镜图

表2 支架的高、长和宽收缩比例比较

图3A、E和I示，支架的一级孔隙分布均匀，呈现圆形或者椭圆形，孔的大小尺寸也较均一；此外，LDM打印的线条连续，没有断裂，而且各条线的粗细也较均匀。通过图3B、F和J进一步观察，进一步证实了一级孔隙较规则，线条和线条之间粘结紧密。图3 C、G和K观察到线条被呈现中间细，两头粗的现象，但并未观察到线条的断裂。图3D、H和L是支架线条的高倍SEM图，从图中可以观察到各支架的次级孔隙较多，并且呈现相互贯通，孔壁光滑，孔隙间也未观察到有颗粒状的物质存在，表明Col的粒度较小，并且与PLCL混合均匀。通过上述结果发现，LDM打印的支架不但具有相互连通的一级孔隙，还有微米级的次级孔隙。通过SEM图可观察到，支架的孔隙、孔隙结构和孔径大小均存在差异。通过测量支架孔径尺寸发现水平面的孔径尺寸更大，形貌和结构相对更加规则。支架在成型腔内成型后，冷冻干燥过程中，由于材料本身的性质，会存在收缩现象，这可能导致原本为规则方形的孔隙变成椭圆形或者方形。

统计复合材料支架的孔径尺寸发现，支架的一级孔径尺寸为 422～795 μm。PLCL/Col-5 和 PLCL/Col-10支架一级孔径尺寸相对PLCL组均较均一，它们的一级孔径均显著小于PLCL组（P＜0.05）。3组支架的次级孔径为2～25 μm，其中PLCL/Col-5的次级孔隙孔径尺寸显著小于其他组（P＜0.05）。PLCL支架的打印线条尺寸为（424±65）μm，显著大于复合支架组（P＜0.05）。打印支架有较高的孔隙率，均在85%左右。PLCL/Col-5的孔隙率为86.5%±3.6%，显著高于其他组（P＜0.05，表3）。

2.4 支架的组分检测

图3 LDM打印支架水平面SEM图

为检测支架的组成成分，证实胶原蛋白已经复合进支架内，如图4所示，分别对PLCL支架、Col原料和PLCL/Col-10支架分别进行红外光谱检测。图4 A为PLCL支架的红外光谱图，1755 cm-1和1734 cm-1为PLCL酯基的伸缩振动峰；1455 cm-1为CH3的C-H非对称与对称弯曲振动峰；1087 cm-1主要是C-C骨架的振动特征吸收峰。图4 B为Col的红外光谱图，在1630cm-1和1549cm-1处分别为为胶原蛋白的酰胺I的C=O伸缩振动吸收峰和酰胺II的N-H特征吸收峰。在图4 C中除了能观察到PLCL在1755 cm-1、1734 cm-1和1455cm-1附近的特征吸收峰外，还观察到在1632cm-1和1550 cm-1处有Col的酰胺I和酰胺II的特征吸收峰。上述结果表明支架中胶原蛋白的存在，证实了PLCL/Col-10支架为复合材料支架。

2.5 支架的力学性能初步观测

在组织工程中，支架不但对细胞的黏附迁移行为具有重要的影响，还为新生组织提供支撑[14,15]。支架具有与周围组织匹配的力学性能是支架达到理想组织工程支架的标志之一[16]。为了观测支架的力学性能和形状恢复能力，如图5所示，分别对支架进行水平挤压测试和垂直压缩测试。如图5 A1-A3所示，所打印支架通过水平挤压10 s后，没有破碎，并且能快速的回复原先形状和尺寸。如图5 B1-B3的光镜图所示，在垂直方向施压10 s后，当力撤掉，支架迅速恢复原状，并保持原本的形态和结构。上述结果表明所打印的3D多孔支架具有良好的力学性能和回弹能力。

3 讨论

单一类型材料不能满足软骨组织工程用于细胞外支架材料的要求，通过一定的方法将几种单一材料复合来增强力学强度、改善降解时间、增加生物活性是目前研究的前沿和热点[17-20]。人工合成高分子材料具有较好的力学性能够，但是其生物相容性较低和降解产物多呈酸性；天然高分子材料生物相容性好，来源广泛，但存在力学性能差的问题。故此实现不同材料的复合，能有效的扬长避短，以制备性能接近理想组织工程支架的支架。

胶原是软骨组织的主要胞外基质成分，来源广泛，具有良好的生物相容性。在支架中加入胶原，能很好的提高支架的亲水性和生物相容性，因此支架材料利用胶原具有先天的优势。PLCL因有一定机械强度、良好的生物相容性、韧性、可降解性、无刺激性和无免疫原性等特殊性质，在软骨与骨损伤修复中应用广泛。更重要的是，其已经被FDA批准使用于临床。胶原和PLCL复合材料的优越性在骨组织工程中研究已得到肯定，但国内外运用于软骨组织工程中却甚少。有研究者使用静电纺丝的方法制备了PLCL和胶原复合材料支架，其体外实验取得积极的结果[21]。但是，静电纺丝所制备的支架存在支架孔径尺寸较小，细胞难以长入的情况，使用此技术制备的支架更适用于覆膜。

表3 支架的孔径尺寸、打印线条尺寸和孔隙率比较（±s）

表3 支架的孔径尺寸、打印线条尺寸和孔隙率比较（±s）

注：与PLCL组比较，△P＜0.05；与PLCL/Col-10组比较，▲P＜0.05

支架PLCL PLCL/Col-5 PLCL/Col-10线条直径（μm）424±65 154±4△227±49△一级孔径（μm）696±99 581±42△485±63△次级孔径（μm）15±6 5±3△▲16±9孔隙率（%）84.2±2.0 86.5±3.6△▲83.3±1.9

图4 LDM打印支架及Col原料红外光谱图

近年来，随着快速成型（3D打印）技术的发展，通过计算机的设计，可以使用打印机实现支架孔径尺寸的精确控制和复杂组织器官的打印[22]。LDM作为一种新型的支架成型技术，具有快速成型技术优势。而它属于绿色制造，可以在温和的条件下处理材料，不损伤材料的性能[10,23]。在LDM打印支架过程中，存在着因溶剂所选范围较小而使其难以打印天然高分子材料和人工合成高分子材料的关键问题[3]。

图5 支架的挤压及回弹和垂直面下压及回弹光镜图

本实验中，新溶剂系统HFIP/DIO被用于同时溶解天然材料Col和合成材料PLCL，配置的溶液成功被LDM打印成型。这种新型的溶剂系统，可以用于溶解多种蛋白类天然材料和合成材料，拓宽了LDM能处理材料的范围和应用。所打印的新型PLCL/Col复合支架，通过初步的形貌表征证实具有规则的相互连通的一级大孔隙，此外组成支架的线条内还有相互连通的微米级的次级孔隙。这些孔隙的存在，将有利于营养的输送和废物的排除，更对细胞的黏附、迁移和增殖具有积极的影响。通过红外光谱检测证实Col的存在，证实所打印支架为复合材料支架。更重要的是，初步的力学观测表明所打印符合支架具有良好的力学性能和形变恢复能力。本实验所打印的支架在组织工程中有具有良好的应用前景。