抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

李晶 余音 陈静 张欣 刘冬阳 黎智 刁庆春 刘素桃 金晶 王灿

400011重庆市中医院皮肤科（李晶、余音、刘冬阳、黎智、刁庆春、刘素桃）；重庆大学附属肿瘤医院 重庆市肿瘤研究所 重庆市肿瘤医院放疗科（陈静、张欣、王灿）；湖北省荆门市第二人民医院手术室（金晶）

实验发现［1］，DKK3（dickkopf-related protein 3）作为抑癌基因通过阻滞细胞周期和诱导凋亡以及影响细胞周期和凋亡的相关蛋白表达抑制人恶性黑素瘤（简称恶黑）的进程，而DKK3在转移性恶黑中的表达及与临床特征的关系尚不清楚，DKK3能否作为功能性抑癌基因抑制恶黑细胞迁移和侵袭尚不清楚。本研究通过验证DKK3对人皮肤恶黑细胞迁移和侵袭的作用及机制，探讨皮肤恶黑的转移相关分子机制。

对象与方法

1.对象：2014年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集58例黑素瘤患者（包括48例原发性黑素瘤和10例转移性黑素瘤）和30例色素痣患者。黑素瘤患者中，男35例（60.3%），女23例（39.7%），34例（58.6%）年龄 ＞50岁；36例（62.1%）病变位于头和躯干，22例（37.9%）位于四肢；肢端雀斑样型29例，浅表扩散型5例，结节型9例，黏膜型15例；病理分期，TNMⅠ+Ⅱ期36例（62.1%）、Ⅲ期22例（37.9%）。色素痣患者中，男21例（70%），女9例（30%），19例（63.3%）年龄＞50岁。黑素瘤患者与色素痣患者性别和年龄分布差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过重庆市中医院医学伦理委员会批准（CQZYY20160109），患者均签署知情同意书。所有皮肤恶黑和色素痣均经重庆市中医院病理科确诊。

2.试剂和仪器：本研究使用的RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、黑素瘤细胞系等均同前期研究［1］。侵袭相关蛋白：上皮钙黏着蛋白（E-cad）、神经钙黏着蛋白（N-cad）、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11的一抗、二抗抗体均为美国Abcam公司产品（一抗为鼠抗人单克隆或多克隆抗体，二抗为山羊抗鼠IgG，内参为β肌动蛋白）。

3.实验方案：先通过Western印迹法检测DDK3蛋白在7株人黑素瘤细胞系和色素痣组织中的表达，再通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测DDK3 mRNA在色素痣、原发性黑素瘤、转移性黑素瘤组织中的表达。然后构建DKK3过表达质粒［pcDNA3.1（+）-Flag-DDK3］转染A375细胞，取成功转染DKK3基因的A375细胞（转染组）与对照组细胞（转染空质粒）进行细胞划痕实验、细胞迁移及侵袭实验，Western印迹法检测迁移与侵袭相关蛋白（E-cad、N-cad、波形蛋白、MMP2、MMP7、MMP11）的表达，qPCR 检测相关基因 mRNA 的表达（2-ΔΔCt法）。mRNA、蛋白的提取与检测方法同文献［1］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 DKK3及黑素瘤迁移与侵袭相关基因引物

4.细胞划痕实验：收集转染组与对照组A375细胞，分别种于无菌6孔板中（约1×105/孔），细胞孵育箱中培养18～20 h，细胞融合度80%～90%时，以无菌小枪头在6孔板底部轻微垂直划线，磷酸盐缓冲液洗去脱落的细胞，以无血清1640培养液继续培养，分别培养开始和18 h后在倒置显微镜下拍照，计算划痕迁移率，评估细胞愈合能力，划痕迁移率越大细胞愈合能力越强。划痕迁移率=（原始宽度-18 h宽度）/原始宽度×100%。

5.细胞迁移实验：收集转染组与对照组A375细胞，倒置显微镜下计数并按5×103细胞/孔接种于Transwell小室上室，下室加入约700 μl 1640培养液（15%），细胞孵育箱中继续培养20 h后取出下室，固定、染色，显微镜下随机取5个视野计算穿出小室细胞数，细胞数量越多迁移能力越强。

6.细胞侵袭实验：实验前在Transwell小室上室铺稀释后的无血清基质胶（无血清1640培养液与基质胶配比为1∶4），并放于细胞孵育箱中，待充分凝固后进行侵袭实验，方法同上述迁移实验。

7.统计处理：采用SPSS 13.0软件，计量资料以±sx表示。两独立样本的比较采用t检验；多组数据的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中的表达：DKK3蛋白在 HM、A375、WM451、SK-MEL-1、Hs-695T细胞系中表达缺失，在MDA-MB-435s、WM35细胞系中表达低于正常色素痣细胞。见图1。

图1 DKK3在人黑素瘤细胞系中的表达 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达，在色素痣细胞中高表达。1：HM；2：A375；3：WM451；4：SK-MEL-1；5：Hs-695T；6：MDA-MB-435s；7：WM35；8、9：色素痣

2.DKK3 mRNA在人皮肤恶黑组织中的表达：DKK3 mRNA在原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中表达水平差异有统计学意义（F=46.57，P＜0.05），转移性黑素瘤DKK3 mRNA表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣，LSD-t分别为2.48、3.12，均P＜0.05。见图2。

图2 DKK3 mRNA在人皮肤黑素瘤及色素痣组织中的表达两两组间比较，均P＜0.001

3.转染DKK3后黑素瘤细胞迁移和侵袭能力：见图3、4。转染组A375细胞培养18 h后划痕迁移率（22.11%±5.11%）低于对照组（54.36%±23.22%），t=2.36，P＜0.001。迁移实验中转染组穿出小室细胞数（265±33）低于对照组（429±41），侵袭试验中转染组穿出小室细胞（76±18）亦低于对照组（135±21），差异均有统计学意义（t值分别为1.24、1.35，均P＜ 0.001）。

图3 转染DKK3对黑素瘤细胞A375划痕实验的影响 转染后18 h，转染组细胞的划痕迁移率低于对照组

图4 DKK3过表达对黑素瘤细胞A375迁移和侵袭的影响 转染组A375细胞迁移与侵袭细胞数少于对照组

4.黑素瘤细胞中迁移和侵袭相关蛋白和mRNA的表达：与对照组相比，转染组A375细胞波形蛋白、N-cad、MMP7、MMP2和MMP11蛋白和mRNA表达水平均降低，E-cad蛋白和mRNA表达水平增高（均P＜0.001）。见图5。

图5 DKK3过表达对黑素瘤细胞A375迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 5A：Western印迹法检测上皮钙黏着蛋白（E-cad）、神经钙黏着蛋白N（N-cad）、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11的表达；5B：实时荧光定量PCR检测A375细胞迁移和侵袭相关mRNA的表达，以转染组mRNA表达水平为1，两组间各基因mRNA表达差异均有统计学意义（P＜0.001）

讨 论

肿瘤侵袭转移是多因素、多步骤参与的复杂过程，皮肤恶黑的侵袭转移和其他恶性肿瘤相似，是一个连续性、动态化的生物学过程［2-3］。肿瘤细胞首先从原发病灶脱落，侵入到细胞外基质，与细胞间质中一些分子黏附，并激活细胞合成、分泌各种降解酶类，协助肿瘤细胞穿过基底膜进入血管、淋巴管，然后在某些因子的作用下运行并穿过血管壁外渗到相应组织滞留，继续增殖，形成转移灶。在前期研究中我们发现，DKK3作为抑癌基因抑制恶黑细胞增殖和促进细胞凋亡［1］。DKK3能否作为预测皮肤恶黑转移的分子标志物尚不清楚。因此，本实验中我们主要关注DKK3对皮肤恶黑细胞迁移和侵袭的影响及相关分子机制。

我们通过Western印迹实验发现，DKK3蛋白在黑素瘤细胞系中呈低表达或缺失，而在正常的色素痣细胞中高表达，这与前期DKK3 mRNA检测结果［1］一致。qPCR检测显示，恶黑中DKK3 mRNA表达下调，转移性皮肤恶黑中DKK3 mRNA的表达低于非转移性皮肤恶黑，提示DKK3可能参与皮肤恶黑的转移。与国外文献报道一致［4］。本实验中，A375细胞转染 pcDNA3.1（+）-Flag-DKK3 质粒后，细胞划痕愈合能力显著低于对照组，同时Transwell迁移和侵袭实验显示，转染后A375细胞的迁移和侵袭能力均明显被抑制。

为进一步探讨DKK3抑制皮肤恶黑细胞迁移和侵袭的分子机制，本研究采用qPCR和Western印迹法分析迁移和侵袭相关mRNA和蛋白的表达。结果显示，过表达DKK3后波形蛋白、N-cad、MMP2、MMP7、MMP11表达显著下降，但E-cad表达上升。E-cad表达缺失是上皮间质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）的关键步骤，而EMT是肿瘤细胞远处转移必经步骤之一，EMT相关信号通路的激活及相互作用介导了肿瘤的侵袭转移、存活以及生长过程［5-7］。最近研究显示发生EMT的细胞可以获得类似于干细胞的特性，这些尚未分化的间质细胞从表达E-cad变为表达N-cad，并且抑制波形蛋白表达，促进一些细胞全能性转录因子如Oct-4和Nanog的表达［7-8］。本研究结果提示，过表达DKK3能够抑制恶黑EMT的变化。MMP表达与癌细胞去分化和侵袭性行为有关，通常提示患者预后不良［9］。本研究结果显示，DKK3可能是潜在的抑癌基因，通过抑制EMT抑制皮肤恶黑的转移。

综上所述，DKK3在人皮肤恶黑细胞和组织中表达下调，过表达DKK3能通过调节EMT抑制黑素瘤细胞的迁移和侵袭，可能成为转移性皮肤恶黑的诊疗靶点。