紫锥菊不定根对LPS诱导的小鼠巨噬细胞促炎介质的影响

韩 璐， 田 文， 高 原， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

紫锥菊(Echinaceapurpurea(Linn.) Moench)又名紫锥花、紫松果菊，菊科紫锥菊属，多年生草本植物，原产于北美地区，是一种药用及观赏植物[1-3]。紫锥菊可全株入药，含有多种有效成分，如烃基酰胺、咖啡酸衍生物及多糖等[4-5]。紫锥菊具有许多药理活性，如免疫调节、抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等药理活性，目前主要应用于防治感冒、支气管炎等上呼吸道系统疾病，皮肤病及过敏性疾病[6-8]。因其有如此多的功效，己被广泛应用于营养补充剂和保健食品。因市场需求量的增加，目前紫锥菊传统的栽培方式无法满足对植物材料的需求。因此，植物细胞培养就成为一种获取植物材料的另一途径。植物细胞、组织和器官具有降低生产成本、缩短生长周期等优点[9]。其中，不定根培养作为器官培养的一种，能够短时间内快速地获得植物有效活性成分，与细胞培养相比较具有更稳定遗传性，是大规模生产次生代谢产物的最佳培养方法。因此，不定根培养技术应用于紫锥菊的植物材料生产具有重要的意义。

炎症是机体对伤害性刺激、组织损伤以及感染等的应激反馈，是一种防御性和保护性反应。一氧化氮(NO)是介导炎症反应的关键因子，由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)诱导合成[10-11]。前列腺素E2(PGE2)是体内的一种花生四烯酸代谢产物，它与机体的发热、炎症反应和细胞生长及分化等生理活动密切相关，PGE2主要由环氧化酶-2(COX-2)诱导合成[12-13]。体内众多的炎症因子中，白介素-6(IL-6)是启动全身炎症反应最强的内源性炎症因子，是机体炎症与疾病严重程度的重要指标。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由活化的巨噬/单核细胞产生，是临床中重要的炎症因子，可参与人体自身免疫病的病理损[14]。白介素-1β(IL-1β)是一种调节自然免疫的细胞因子，能诱导调控其他炎性反应介质在多种细胞中的分泌与释放[15]。目前关于紫锥菊抗炎方面的研究已有一些报道，如莫秋芬等[16]得出，紫锥菊植物提取物可抑制TNF-α、IL-1β等促炎因子的释放；程学勇等[6]研究表明紫锥菊花具有良好的抗炎活性。然而，目前对紫锥菊不定根抗炎特性的研究尚处于一种空白状态，限制着不定根的应用。因此，探明不定根的抗炎活性，对今后不定根作为相关产品的应用提供理论依据，同时还可解决紫锥菊原材料短缺的问题。

因此，本试验利用生物反应器培养的紫锥菊不定根提取物处理LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)后，通过测定PMs中的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎介质的释放量及iNOS和COX-2的表达量，探明紫锥菊不定根的抗炎活性。

1 材料与方法

1.1 材料

紫锥菊不定根组培材料由大连市农业科学研究院提供。将不定根接种于含有4 L培养液(3/4MS+IBA 1 mg/L+50 g/L，pH值5.8)的5 L反应器中，通气量为100 mL/min，温度为25 ℃条件下进行暗培养。将培养40 d的不定根作为本试验的试验材料。

1.2 药品

DMEM培养基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美国)，青霉素、链霉素和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Sigma公司，美国)，IL-1β抗体、TNF-α抗体及IL-6抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，LPS(Invivogen公司，美国)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司，美国)。

1.3 仪器

酶联免疫检测仪(UV-2600，日本岛津公司，日本)，蛋白质电泳及转印设备(Bio-Rad公司，美国)，凝胶成像仪(LAS-3000，Fujifilm公司，日本)。

1.4 动物

6～8周龄的C578BL/6雌性小鼠，体重为(18±1) g，购买自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，试验均符合动物伦理委员会标准。

1.5 方法

1.5.1 小鼠腹腔巨噬细胞的获取

C57BL/6雌鼠腹腔注射3 mL的4 %巯基醋酸盐培养液，4 d后牺牲小鼠，向小鼠腹腔注射10 mL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)灌洗腹腔后，收集细胞悬液，于1 500 r/min下离心3 min，除上清，即得PMs。将细胞培养在含10 %FBS和抗生素(青霉素和链霉素，100 U/mL)的DMEM培养基中，在37 ℃和25% CO2培养箱中孵育12 h后用于试验。

1.5.2 不定根提取物对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响

采用MTT法研究不定根提取物对PMs活性的影响，不定根提取物用DMSO溶解用于试验。用DMEM培养基将不定根提取物分别配置成12.5、25、50、100、200、400 μg/mL后，处理孵育在96孔板中的PMs，每孔8×104个细胞。孵育24 h后弃培养液，每孔加入100 μL MTT(500 ng/mL)后继续孵育，2 h后，弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，充分摇匀后，利用酶联免疫检测仪测定吸光值(OD)，波长为550 nm，根据计算出的细胞活性，筛选出最适的提取物浓度。

1.5.3 不定根提取物对促炎介质的影响

为了研究不定根提取物对NO的影响，将PMs接种于48孔板中，每孔2.5×105个细胞，孵育12 h后，弃培养液，温PBS洗涤2次，每次3 min。分别加入25、50、100、200、400 μg/mL不定根提取物处理PMs，1 h后处理组和LPS组分别加入0.1 μg/mL LPS，24 h后收集细胞上清液。利用Griess试剂盒说明书的操作，于550 nm处测定OD值。

PGE2测定中对细胞的处理与NO的相同，按照ELISA试剂盒说明书测定PGE2，在450 nm处测定OD值，并计算出其释放量。

为了研究不定根提取物对TNF-α、IL-6的影响，在48孔中每孔加入2.5×105细胞，孵育12 h，弃上清液，用温PBS缓冲液洗涤2次，加入提取物处理1 h，处理组和LPS组加入0.1 μg/mL LPS处理，6 h后收集细胞上清液。参照ELISA试剂盒说明书进行测定，450 nm处测定OD值，计算TNF-α和IL-6的释放量。

为了研究不定根提取物对1L-1β的影响，将PMs接种到48孔板中，每孔2.5×105细胞，孵育12 h后，弃培养液，使用温PBS缓冲液洗涤2次，加入0.1 μg/mL LPS处理3 h后，用提取物处理1 h，用5 mM的ATP处理1 h后收集细胞上清液。参照ELISA试剂盒说明书进行测定，450 nm处测定OD值，计算1L-1β的释放量。

1.5.4 不定根提取物对iNOS、COX-2的影响

采用免疫印迹试验法，测定不定根提取物对iNOS、COX-2表达的影响。将小鼠巨噬细胞接种于6孔板中(每孔2.6×105细胞)，孵育12 h后，弃培养液，用温PBS缓冲液洗涤3次，处理组和LPS组加入0.1 μg/mL LPS处理24 h。弃上清液，用冰PBS缓冲液洗涤3次后，每孔加入100 μL裂解液，刮取细胞后，冰浴30 min。4 ℃离心(12 000 r/min)15 min后，收集上清液，采用BCA法测定蛋白含量，进行免疫印迹分析。采用SDS-PAGE电泳法分离后，转移到PVDF膜。室温下，用10 %的脱脂奶封闭1 h。4 ℃条件下分别孵育一抗(iNOS、COX-2、β-actin，1∶1 000)过夜，室温条件下，在二抗(1∶5 000)中孵育1 h。加入ECL试剂盒中，分别利用凝胶成像仪曝光成像，并利用Image J软件对其进行分析。

1.5.5 数据分析

所有试验处理均采用3次重复。使用GraphPad Prism 5软件程序，采用t测验对数据进行比较；采用SPSS 21软件程序，采用邓肯式新复极差法对数据进行分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不定根提取物对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响

为了筛选出最适宜的不定根提取物浓度进行抗炎试验研究，通过测定不定根提取物对细胞活性的影响，对提取物的细胞毒性进行了评价。

由图1可知，分别用0～400 μg/mL不定根提取物处理PMs时，其活性无明显变化，这说明不定根提取物在此浓度范围内，对PMs无毒性。因此，选取25、50和100 μg/mL 3个浓度进行后续抗炎研究。

图1 不定根提取物对细胞活性的影响

2.2 不定根提取物对NO和PGE2释放量的影响

NO作为一种参与许多生理调节功能的信号分子，也是一种检测炎症反应的重要指标。为探明不定根提取物对LPS刺激的PMs中NO释放量的影响，本试验分别采用25、50和100 μg/mL 3种浓度的不定根提取物对PMs进行处理。结果表明，经过LPS刺激后的PMs中NO的释放量明显高于未处理组。当不定根提取物浓度为25 μg/mL时，与LPS组的NO释放量无显著性变化。当不定根提取物浓度为50 μg/mL时，NO的释放量为7.44 μM，显著低于LPS组(图2A)。

PGE2是花生四烯酸的环氧酶的代谢产物，是一种重要的细胞生长调节因子，也是一种重要的促炎因子，可以反馈性诱导合成COX-2，从而使炎症的强度和时间进一步增加。由图2B可以看出，经过LPS刺激的PMs中PGE2的释放量明显高于空白组，当不定根提取物浓度为25 μg/mL时，与LPS组相比较PGE2释放量明显有所降低。随着提取物浓度的升高，PGE2释放量呈下降趋势，当浓度为50 μg/mL时，PGE2释放量明显低于LPS组，为193.60 pg/mL。

注：###为与空白组比较，为0.001水平的差异显著性；*，**，***为与LPS组比较，分别为0.05,0.01和0.001水平的差异显著性，下同。

图2不定根提取物对细胞NO和PGE2释放量的影响

Fig.2EffectofadventitiousrootextractsonNOandPGE2productionincells

2.3 不定根提取物对IL-1β、IL-6和TNF-α释放量的影响

IL-1β作为促炎细胞因子，主要表现在组织受到损伤后其迅速增加，还可以对其他促炎细胞因子的释放进行诱导，从而进一步引发炎症反应。为了探明不定根提取物对LPS刺激的小PMs中IL-1β释放量的影响，采用25、50和100 μg/mL 3种浓度的不定根提取物对PMs进行处理，结果表明，不定根提取物对IL-1β释放量具有显著的抑制效果。(图3A)。

IL-6作为促炎介质不仅参与炎症反应和感染反应，还参与调解代谢过程，能够调控组织炎症的浸润，是诱发炎症过程的主要因素。由图3B可以看出，经过LPS刺激的PMs中IL-6释放量显著增加，但不定根提取物对IL-6释放量并没有抑制作用。

TNF-α是炎症反应中最早研究的促炎介质，在炎症反应中起着主导作用，能够激活细胞因子级联反应，进一步诱发相关炎症因子的释放。为了探明不定根提取物对LPS刺激的PMs中TNF-α释放量的影响，分别用25、50和100 μg/mL 3种浓度的不定根提取物对PMs进行处理，结果表明，经过LPS刺激后的PMs中TNF-α的释放量明显高于未处理组，但采用不定根提取物处理后的PMs中的TNF-α释放量明显降低，当不定根提取物浓度为50 μg/mL时，TNF-α的释放量显著低于LPS组(图3C)。

图3 不定根提取物对细胞IL-1β、IL-6和TNF-α释放量的影响

2.4 不定根提取物对iNOS和COX-2表达量的影响

iNOS是合成NO的关键酶，当受到外界刺激被激活后，可以诱导合成大量的NO。本试验为了探明不定根提取物对iNOS表达量的影响，分别用不同浓度的提取物处理PMs，结果表明，当不定根提取物浓度为25 μg/mL时，对iNOS的表达量有抑制作用，并随着浓度的增加，表示出剂量依赖性(图4A)。

COX-2是一种诱导型氧化酶，是PGE2合成的关键酶，当生物体受到外界刺激时，此种酶的表达量会上升，以促进炎症反应的进一步发生。由图4B可以看出，经LPS处理的PMs中COX-2表达量显著增加，经不定根提取物处理的PMs中COX-2表达量明显低于LPS组，这表明不定根提取物具有较好的抑制效果，且当浓度为50 μg/mL时，显著抑制了COX-2的表达量。

图4不定根提取物对细胞iNOS和COX-2表达量的影响

3 讨论与结论

紫锥菊作为一种具有多种药理活性的天然药用植物，含有多酚、咖啡酸衍生物、多糖、烷基酰胺、挥发油等有效物质，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等药理活性[17-20]。然而对于紫锥菊抗炎活性的研究报道主要集中在野生或栽培植株，并没有对生物反应器生产的不定根抗炎活性的研究[21]。因此本试验对紫锥菊不定根提取物的抗炎活性进行了研究。

LPS刺激的巨噬细胞能够释放TNF-α，TNF-α通过活化模式受体，从而活化巨噬细胞，产生相关炎症因子，如IL-6、IL-1β、NO和PGE2[22]。IL-6能够刺激活化B细胞增殖，分泌抗体，刺激T细胞增殖及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化，刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应，促进血细胞发育，是炎症发生过程中重要的细胞因子[23]。IL-1β是白介素-1(IL-1)的一种存在形式，其能够在炎症反应中吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放[24]。贾青辉[8]研究发现，紫锥菊提取可以有效的抑制TNF-α、IL-1β、PGE2等促炎因子的表达，进而抑制炎症因子的分泌，这与本试验的结果一致。NO作为许多生理调节功能的信号分子，也是一种检测炎症反应的重要指标，其合成是在iNOS的参与下完成的，iNOS主要在高活性的巨噬细胞与白细胞中表达[25]。PGE2是一类高活性的炎症细胞因子，在正常细胞中几乎不表达，但是受到外界刺激后，会激活3个连续的酶促反应，在COX-2催化下由花生四烯酸生成[26]。Zhai Z等[27]研究表明，紫锥菊乙醇提取通过抑制RAW 264.7细胞中NO和iNOS的表达，而达到了抗炎的效果。本试验的结果与其相同，这表明紫锥菊不定根同样具有抗炎作用。

本文利用LPS刺激小鼠巨噬细胞构造炎症模型，测定紫锥菊不定根提取物对相关炎症因子(TNF-ɑ、IL-6、IL-1β)与促炎介质(NO、PGE2、iNOS、COX-2)表达的影响，结果发现，在一定浓度范围内，不定根提取物浓度能够有效的降低炎症因子(TNF-ɑ、IL-1β)与促炎介质的(NO、PGE2、iNOS、COX-2)的表达，这说明紫锥菊不定根具有一定的抗炎活性，因此，紫锥菊不定根可以作为紫锥菊抗炎相关产品的原材料。