自体胆汁逆行胰管注射诱导比格犬重症急性胰腺炎模型建立

耿 诚， 孟意程， 徐新建， 聂晓涵， 白晨光， 王喜艳

(新疆医科大学1第一附属医院消化血管外科中心胰腺外科， 乌鲁木齐 830054； 2附属肿瘤医院， 乌鲁木齐 830011)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)发病是由各种因素影响的,虽然现在救治上有明显的进步，有关基础和临床研究取得了一定的进展，但SAP的死亡率仍未改善[1-2]。进一步改进救治方法及提高该病治愈率、减少并发症，借助于SAP动物模型进行研究仍是重要手段，目前动物模型的制作方法较多，本研究旨在探讨建立接近人生理状态的犬 SAP 模型的可行性，为今后深入研究SAP发病机制提供实验模型。

1 材料与方法

1.1动物与分组健康比格犬12只，雌雄不拘，年龄1～2岁，质量 10～12 kg(平均11.2 kg)，由新疆医科大学实验动物中心提供，随机分为2组，每组6只犬，分为SAP造模组(n=6)和假手术组(n=6)。

1.2实验材料氯胺酮(上海第一生化药业公司), 2.5%硫喷托纳，麻醉机(Drager Fabius Tiro，德国)，8Fr三腔中心静脉导管(Arrow，美国)，PiCCO系统(Pulsion Medical Systems，德国)，比格犬自身胆汁，0.9%生理盐水(新疆华世丹药业)。

1.3方法比格犬在饲养室饲养1 w，定量进食，自由饮水,制模前禁食12 h，禁饮4 h，以氯胺酮10 mg/kg肌肉注射基础麻醉，颈部过伸位固定于手术台上，行气管内插管(ID 6.5 mm)，气管导管接麻醉机机控呼吸，吸入氧浓度为40%(FiO2:0.4)，潮气量(Vt)：10 mL/kg，呼吸频率(Rf)：25～35次/min，吸∶呼(I∶E)为1∶1.5，2.5%硫喷妥钠维持麻醉，持续微量泵泵入；留置尿管记录尿量，双侧颈部和腹股沟区用电动理发剪备皮并用碘伏消毒；从右颈外静脉穿刺置人8Fr三腔中心静脉导管，将导管尖端置入上腔静脉与心房交界处(置入深度以在监护仪上出现CVP波形为准)，建立静脉通道；切开左侧腹股沟区，显露双侧股动脉，左侧连接PiCCO系统监测心率(HR)、平均动脉压(MAP)、心输出量指数(CI)等[3]。上腹正中切口进腹，自胆囊底部穿刺抽取犬自身胆汁备用，间断缝合关闭胆囊穿刺口，切开十二指肠对侧系膜缘，找到主胰管开口，采用BD套管针针头逆行插管并外接输液泵，以10 mL/h的速度注入自身胆汁1 mL/kg，可见胰腺颜色改变，注射完毕后保持压力不变，5 min后拔管，同时丝线结扎主胰管，间断缝合十二指肠切口，逐层关腹(如图1、2)。对照组仅给予插管，观察期间持续静脉注射理盐水1 mL·kg-1·h-1,经动脉导管取得动脉血行血气分析,测定动脉氧分压。经静脉套管采集静脉血检测血常规及生化指标。

1.4指标监测观察各组比格犬术后一般情况。每隔1小时用10 mL注射器经颈内静脉导管快速注入(<5 s)5 mL冰冻盐水(0～4℃)连续测3次取均值，记录CI、SVRI、MAP时各项指标的变化。待实验结束后颈动脉放血处死，进行大体解剖。记录腹腔积液量以及性状，切取胰腺组织，用10%甲醛溶液固定24 h后制作切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察组织病理学变化。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

2 结果

2.1胰腺组织病理切片与造模成功率在本次实验周期内，比格犬无死亡。对照组比格犬胰腺组织外观除轻度水肿外均正常；SAP造模组动物的胰腺大体形态学显示明显水肿、出血、坏死及广泛的胰周脂肪组织坏死和皂化(图3)。本组动物造模率为100%。胰腺组织病理切片提示，SAP造模组HE染色切片镜下可见胰腺组织中有大片凝固性坏死，细胞结构不清，间质小血管壁坏死、出血。坏死区周围有大量中性粒细胞及单核细胞浸润(图4)，对照组HE染色切片可见胰腺间质水肿伴少许中性粒细胞浸润，腺泡和导管基本正常(图5)。

图3 胰腺大体形态学可见胰腺组织出血坏死明显，胰周亦可见出血、皂化斑形成

图4 SAP造模组胰腺镜下可见出血坏死明显，大量中性粒细胞以及单核细胞浸润

图5 对照组可见胰腺间质水肿伴少许中性粒细胞浸润，腺泡和导管基本正常

2.2各时间点血流动力学指标的变化造模前造模组和对照组的CI、MAP、SVRI、PaO2-FiO2比较差异均无统计学意义(P>0.05)。造模后，造模组CI呈先上升后下降趋势，12 h时造模组CI为(1.94±0.64)L·min-1·m-2，明显低于对照组[(3.42±0.40)L·min-1·m-2]，差异有统计学意义(P<0.05)。造模组MAP均逐渐下降，8 h时造模组MAP为(65.67±6.38)mmHg,明显低于对照组[(73.83±3.49)mmHg]，差异有统计学意义(P<0.05)。造模组SVRI 1～2 h期间未见明显变化，随后持续上升，在第8小时达到峰值后呈持续减低状态，并于12 h实验结束时明显低于对照组，而对照组SVRI则无明显变化，造模组SVRI为(1 444.83±396.92)dyne·s·cm-5·m2,明显低于对照组[(2225.83±299.39)dyne·s·cm-5·m2]，差异有统计学意义(P<0．05)。造模组PaO2-FiO2呈持续下降趋势，8 h时造模组PaO2-FiO2为(341.83±64.16)mmHg,明显低于对照组[(415.83±24.71)mmHg]，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 采用自身胆汁逆行胰管注射制备重症急性胰腺炎模型比格犬各时间点血流动力学指标

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

目前随着相关亚专业研究的进一步深入，对于胰腺炎的临床病因以及治疗研究和与之相关的基础研究已经进入到分子水平，稳定、可靠的动物模型制作将为相关研究的进一步进展提供确切的保障[4-6]。目前临床常用的造模动物有小鼠、大鼠以及家兔等，建立模型后可进行相关基因研究以及药物临床试验，但是若研究重症急性胰腺炎相关机械通气，液体复苏以及血流动力学指标改变，因上述动物体积较小，相关研究可能无法实现。

目前胰腺炎造模的方法主要包括雨蛙素注射法、L-精氨酸注射法与逆行牛磺胆酸钠胰管注射法。雨蛙素注射法相对损伤较小，具有较高可重复性与操作便捷性，可采取多种方式给药等诸多优点，但所造成的胰腺炎多为轻症水肿型胰腺炎，并无出血坏死以及全身系统性炎症反应出现，故不适用于重症胰腺炎造模。L-精氨酸注射法同样具有相对损伤较小，具有较高可重复性与操作便捷性等优点，缺点是成活率低，不易大规模采用[7]。本组比格犬造模采取了自体胆汁逆行胰管注射法，该法与目前广泛开展的逆行牛磺胆酸钠胰管注射法相比较，有以下优点:第一，贴近疾病发展的规律，对于牛磺胆酸钠胰管注射诱导的大动物重症急性胰腺炎模型来说，大动物有着较强的胆汁酸耐受能力，严重程度较大鼠明显减轻[8-9]，造模成功率偏低。自体胆汁中含有甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate)、钙离子等多种加重炎症反应的成分，且胆汁利于细菌繁殖，细菌产生内毒素进一步加重胰腺炎，使得重症急性胰腺造模成功率接近100%；第二，采用自身胆汁进行逆行胰管注射法，价格低廉，且较牛磺胆酸钠方便快捷。

目前已知SAP的致死原因与过度炎症反应和粒细胞过度激活有关[10]。这种炎症反应综合征(SIRS)能诱发远处脏器损害，导致疾病早期出现MODS[11-13]。本组试验中，SAP造模组前期2～4 h CI与SVRI增加，可能与急性炎症导致机体启动应激系统，产生大量肾上腺素、去甲肾上腺素及糖皮质激素，造成外周血管收缩、短期升高，心率和心输出量增加相关，CI与SVRI均增加；后期 CI与SVRI持续降低，可能与重症急性胰腺炎所释放的炎症介质有关，如：缓激肽和胰激肽等血管扩张物质，舒张血管，造成血管内皮损伤，导致外周血管阻力下降；肿瘤坏死因子、白介素等细胞因子增加毛细血管通透性，导致细胞外液聚集在腹腔第三间隙形成多浆膜腔积液，进一步较少有效循环血量[14-16]。PaO2/FiO2在SAP造模组中持续下降，而对照组中基本保持正常，可能与造模成功后的炎症因子释放，造成肺泡表面活性物质破坏，引起肺不张、肺水肿，从而造成吸气阻力增加、通气血流比例失调，造成氧分压降低，继而导致氧和指数持续降低，最终发展为呼吸衰竭。

综上所述，SAP造模组造模成功后,CI、SVRI先上升后下降,MAP、PaO2/FiO2随时间延长逐步降低，证明胆汁逆行胰管注射法成功诱导比格犬SAP模型，是可行的，且有造模成功率高，贴近疾病发展规律的优点。