液相色谱-串联质谱法测定水产品中亮绿、亚甲基蓝及其代谢物残留量

余玮玥，黄冬梅，史永富，孔 聪，田良良，韩 峰，张政权

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院 东海水产研究所农业部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090)

亮绿(Brilliant green,BG)属于三苯甲烷类染料，与孔雀石绿的分子结构式相似。亚甲基蓝(Methylene blue，MB) 又名次甲基蓝、碱性湖蓝，属于人工合成的噻嗪类染料，最早应用于治疗细菌性痢疾[1]。孔雀石绿因具有高毒、高残留以及致癌、致突变等特点[2]，已被许多国家禁止在水产养殖中使用，而有些养殖户将亮绿及亚甲基蓝作为替代品使用。亮绿具有抗微生物、抗寄生虫和抗真菌特性，但同时也有一定的毒性，具有致突变和致癌作用，会影响水生生物和人类的健康[3-4]。亚甲基蓝在水产养殖中可用于治疗淡水鱼类的小爪虫病、红嘴病、斜管虫病等，也可用作消毒剂降低存养池中的微生物量[5]。亚甲基蓝在生物体中经过代谢，分子结构发生变化，其代谢产物分别为天青A(Azure A，AZA)、天青B(Azure B，AZB)和天青C(Azure C，AZC)。高浓度的亚甲基蓝对水生生物有毒性甚至致其死亡[6]，并会通过食物富集作用对人体造成危害，因此需要建立水产品中亮绿、亚甲基蓝及其代谢物残留量的检测方法。

近年来，国内外对亮绿、亚甲基蓝及其代谢物残留的检测方法有分光光度法[7-8]、毛细管电泳法[9-10]、电化学法[11-12]、液相色谱法[13-14]以及液相色谱-串联质谱法[15-17]等。其中液相色谱法和液相色谱-串联质谱法应用较多，但液相色谱法可能因样品中干扰物质的存在导致定性不准确，而液相色谱-串联质谱法检测器的灵敏度较高，能提供丰富的结构信息，可通过母离子、子离子等信息进行确证，从而提高了检测的准确性[18]。目前同时检测亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的方法报道较少，且尚未建立水产品中亮绿、天青A、天青B和天青C同时检测的国家标准方法。侯建波等[15]采用液相色谱-串联质谱法对亮绿、亚甲基蓝及其代谢物进行同时测定，以MCAX柱净化，需使用2种洗脱液，洗脱过程繁琐且前处理时间长。惠芸华等[19]采用高效液相色谱-串联质谱法测定孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝等6种阳离子染料，但未检测亮绿及亚甲基蓝代谢物。Tarbin等[20]采用液相色谱-串联质谱法对亮绿、亚甲基蓝及天青B进行检测，检出限分别为1.1、14.0、6.2 μg/kg。本实验建立了水产品中亮绿、亚甲基蓝及其代谢物同时检测的方法，采用PRS固相萃取柱，仅用1种洗脱液即可完全洗脱目标物，有效缩短了前处理时间，且灵敏度较好，适用性强，能满足水产品中药物残留的检测要求，为制定水产品中亮绿、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定标准奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher 公司)；16RⅫ 高速冷冻离心机(日本 Hitachi CF公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore 公司)；VisiprepTMDL固相萃取装置(美国Supelco公司)；BT 423S电子精密天平(Sartorius公司)；Genius 3 旋涡混合器(德国 IKA 公司)；KQ-300E超声波提取仪(昆山市超声仪器有限公司)；V-700 旋转蒸发器(瑞士Buchi公司)；N-EVAPTM112型氮吹仪(美国Organomation公司)；ST3100 pH计(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；Bond Elut PRS固相萃取柱(500 mg/3 mL，美国Agilent 公司)。

亮绿(纯度96%，德国Dr.Ehrensorfer公司)；亚甲基蓝(98%，美国Fluka公司)；天青A(80%)、天青C(50%)(山东西亚化学工业有限公司)；天青B(98%，美国Sigma公司)；乙腈、甲醇、二氯甲烷(J.T.Baker公司)，甲酸(Fluka公司)，乙酸铵(Aladdin公司)均为HPLC级；盐酸羟胺、对甲苯磺酸、二甘醇均为分析纯；洗脱液为0.1 mol/L乙酸铵(pH 4.5)-乙腈(1∶1，体积比)。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：称取亮绿、亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C标准品各10.0 mg(精确至0.000 1 g)，分别用甲醇溶解，并定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L 的单标储备液，于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存，有效期6个月。

混合标准中间液：分别准确移取适量100 mg/L单标储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成亮绿、亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C均为1 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃棕色玻璃瓶中保存，有效期3个月。

1.3 样品前处理

1.3.1提取称取2.0 g试样(精确至0.01 g)于30 mL塑料离心管中，加入250 g/L盐酸羟胺 1 mL、0.5 mol/L对甲苯磺酸 2.5 mL、0.1 mol/L乙酸铵(pH 4.5)5 mL和乙腈10 mL，涡旋混匀1 min，50 ℃下超声提取15 min。于5 ℃下高速离心(10 000 r/min)10 min，移取上清液至50 mL塑料离心管中，残渣再用10 mL乙腈重复提取1次，合并上清液，混匀，待净化。

1.3.2净化向塑料离心管中加入2 mL二甘醇和20 mL二氯甲烷，涡旋混匀1 min，静置30 min，6 000 r/min离心10 min，下层溶液转移至50 mL鸡心瓶中，上层溶液中加入5 mL乙腈和15 mL二氯甲烷进行萃取，合并下层溶液，浓缩至2 mL左右。加入5 mL乙腈溶解，涡旋混匀1 min，超声5 min。将溶液过经5 mL乙腈活化的PRS固相萃取柱，以2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗并减压抽干，加入5 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于40 ℃下氮吹至3 mL(若低于3 mL，则用乙腈定容至3 mL)，过0.22 μm滤膜后，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18柱(2.0 mm×100 mm，3 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：25 μL；流动相：A为2 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)，B为乙腈，C为甲醇。梯度洗脱程序：0～1.0 min，80%A，10%B；1.0～8.0 min，80%～5%A，10%～45%B；8.0～10.0 min，5%A，45%B；10.0～10.1 min，5%～80%A，45%～10%B；10.1～14.0 min，80%A，10%B。

1.5 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测方式：选择反应监测模式(SRM)；扫描方式：正离子模式；喷雾电压：3 500 V；鞘气压力：20 kPa；辅助气压力：10 kPa；离子传输毛细管温度：320 ℃。亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的母离子、子离子和碰撞能量见表1。

表1 亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的质谱分析参数Table 1 Mass spectrometric parameters of brilliant green,methylene blue and its metabolites

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1色谱柱的选择文献显示[19,21]，C18填料的色谱柱可对亮绿、亚甲基蓝、天青A、天青B和天青C进行有效分离。实验对比了粒径分别为3 μm和5 μm的CAPCELL PAK C18色谱柱，结果发现粒径为3 μm的色谱柱柱效高于5 μm色谱柱，天青C在粒径为5 μm的色谱柱上出峰时间为3.87 min，比3 μm色谱柱上的出峰时间提前1 min左右，且目标峰附近有干扰。因此，选择粒径为3 μm的CAPCELL PAK C18柱，可实现5种化合物的良好分离。

2.1.2流动相的优化对水产品中渔药、兽药残留进行检测时，一般选用乙腈、甲醇和水作为流动相，并在流动相中加入甲酸提高离子化效率,加入乙酸铵改善峰形、减少拖尾[22]。分别考察了0.1%甲酸-乙腈、2 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈和2 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈-甲醇3种流动相的分离效果，发现以0.1%甲酸-乙腈或2 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈为流动相时，天青C的峰形不稳定且拖尾严重。甲醇因极性较大可将目标物更好地从色谱柱上洗脱，因此流动相中加入甲醇后天青C的峰形得到改善，其余4种目标化合物均能较好分离且峰形尖锐。图1为最优条件下亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的提取离子流图。

图2 不同提取溶剂对5种化合物回收率的影响Fig.2 Effect of different extraction solvents on recoveries of five compounds

2.2 样品前处理方法的优化

2.2.1提取溶剂与萃取溶剂的选择亮绿、亚甲基蓝及其代谢物易溶于乙腈、甲醇、水等溶液，而水产品的基质复杂，含有大量脂肪和蛋白质，由于乙腈具有沉淀蛋白的作用[23]，因此选择乙腈作为主要的提取溶剂。考察了乙腈、乙腈-乙酸乙酯、乙腈-二氯甲烷、乙腈-乙酸铵缓冲溶液(盐酸羟胺、对甲苯磺酸和乙酸铵溶液)的提取效果(图2)，发现以乙腈、乙腈-乙酸乙酯或乙腈-二氯甲烷为提取溶剂时，亮绿和天青C的回收率仅为50%左右，而用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取可有效提高回收率。这是因为提取溶剂中加入盐酸羟胺可防止目标物被氧化[24]。此外，由于5种化合物均为阳离子型化合物，选择对甲苯磺酸作为离子对试剂，在酸性环境下可与目标物形成离子对，使其更易被有机试剂提取[25]。因此，最终选择乙腈-乙酸铵缓冲溶液作为提取溶剂。

为更有效去除水产品中的杂质，本实验采用二氯甲烷作为萃取溶剂进行液液萃取净化，利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的差异，使化合物从一种溶剂转移到另一种溶剂中。实验中加入乳化剂二甘醇，可使水相和有机相混合均匀，有利于二氯甲烷将水中的乙腈萃取完全，在旋蒸过程中也可防止爆沸[26]。此外，进行第二次反萃取时加入乙腈作为介质可提高萃取效率[13]。

2.2.2固相萃取柱的选择亮绿、亚甲基蓝及其代谢物均为阳离子型化合物，因此考察了N-丙基乙二胺固相萃取柱(PSA)、HLB柱和丙磺酸固相萃取柱(PRS)对目标物的吸附和净化作用。结果表明，通过型萃取柱PSA柱对天青C的吸附较大，回收率为60%左右，其余目标化合物的回收率为77.1%～87.1%；HLB柱采用乙酸铵上样，甲醇洗脱，天青C的回收率仅为40%左右，其他目标化合物的回收率为75.9%～96.2%，并且HLB柱对杂质的净化效果差，样液较浑浊；而PRS柱是以硅胶为基质的强阳离子交换萃取柱，键合官能团为丙基磺酸，其不仅能将5种目标化合物吸附，并且采用乙腈-0.1 mol/L乙酸铵(pH 4.5，1∶1)混合溶液能将其完全洗脱，回收率均在90%以上，且净化后溶液澄清。因此实验选用PRS柱进行固相萃取。

实验对洗脱液用量(2、3、5 mL)进行了优化，结果发现洗脱液用量少时不能将目标物完全洗脱。洗脱液用量为3 mL时，亚甲基蓝的回收率仅为35.6%；洗脱液用量为5 mL时可将所有化合物完全洗脱，且回收率均高于90%，因此选择洗脱液用量为5 mL。

2.2.3浓缩体积的优化试验过程中，萃取所得溶液需要旋蒸浓缩，但旋蒸至干时某些化合物有损失，亮绿、天青A和天青C的回收率分别为69.5%、52.2%和79.2%，因此选择将溶液旋蒸至约2 mL，以减少损失。收集的固相萃取柱洗脱液氮吹浓缩时也会导致损失，天青A和天青B的回收率仅分别为46.3%、52.9%，考虑到洗脱液中有水分较难吹干，因此最终选择氮吹浓缩至3 mL。

2.3 基质效应的研究

基质效应是样品基质中含有的内源性化合物影响液相色谱-串联质谱信号强度的现象[27]。其计算公式为：基质效应=(1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%[28]。结果表明，样品基质对5种目标物的基质效应为40.1%～75.3%。由于存在基质抑制效应，因此本实验采用空白基质溶液配制标准曲线以减少基质干扰，提高样品定量结果的准确性。

2.4 方法有效性评价

2.4.1线性范围、检出限及定量下限以空白基质溶液配制1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L的混合标准工作溶液，采用本方法进行分析，以标准溶液的质量浓度(X，μg/L)为横坐标，各化合物定量离子的色谱峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。选取空白鲫鱼作为样品基质进行加标实验，加标水平为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/kg，按照本方法提取净化后进行分析，以不低于3倍信噪比(S/N≥3)且满足方法准确度要求时对应的目标物浓度为检出限(LOD)，以S/N≥10对应的浓度为定量下限(LOQ)[29]。亮绿、亚甲基蓝及其代谢物在1.0～100.0 μg/L范围内呈良好的线性关系(r2>0.999)，LOD均为1.0 μg/kg，LOQ均为2.0 μg/kg(表2)。

2.4.2回收率与相对标准偏差以阴性鲫鱼为样品进行加标回收实验，加标水平为1.0、5.0、10.0 μg/kg，每个加标浓度平行测定6次，计算回收率及批内相对标准偏差(RSD)。亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的平均回收率为70.3%～92.1%，RSD为2.3%～13%(表2)。本方法的准确度和精密度能够满足微量分析的要求。

表2 亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的线性范围、方法检出限、定量下限、回收率和相对标准偏差Table 2 Linear ranges,LODs,LOQs,recoveries and relative standard deviations of brilliant green,methylene blue and their metabolites

2.5 实际样品的检测

将已建立的方法应用于实际样品的检测，在上海江杨农产品批发市场抽取的鲫鱼、大黄鱼、南美白对虾和大闸蟹24个样品中均未检出目标化合物。另采用该方法对本课题组开展的药代实验中取得的阳性样品进行测定，以200 μg/L的亮绿溶液对体重为200～300 g的鲫鱼进行药浴实验。于不同时间收集鲫鱼样品，每个时间点取3条鲫鱼，利用本方法进行检测。某时间点测得3条鲫鱼肌肉中亮绿的含量分别为31.3、35.9、30.3 μg/kg，其他实验室采用本方法对该样品的检测结果分别为30.5、34.7、29.3 μg/kg，与本实验室测定结果较一致。

3 结 论

本文利用液相色谱-串联质谱建立了水产品中亮绿、亚甲基蓝及其代谢物残留的同时检测方法，通过使目标化合物形成离子对提高了提取效率，采用二氯甲烷液液萃取和PRS固相萃取柱相结合的方法净化样品，有效去除了杂质，降低了干扰。在最佳实验条件下，5种化合物在1.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好，检出限均为1.0 μg/kg，定量下限均为2.0 μg/kg；回收率为70.3%～92.1%，RSD为2.3%～13%。将该方法应用于药代实验中实际阳性样品的检测，与其他实验室的检测结果一致。该方法准确度高、实用性强，能满足实际样品中亮绿、亚甲基蓝及其代谢物的检测要求。