超高效液相色谱法同时测定牙膏中5种植物源活性成分

杨 培，谭建华，李慧勇，郭长虹，熊小婷，夏泽敏，李少飞，莫庭源，廖惠媚

(广州质量监督检测研究院，广东 广州 510000)

天然植物中存在丰富的生物活性物质，早在1985年，已有1 600多种植物被报道具有抗真菌、抗细菌等防止有害生物的活性[1]。随后，国内外的大量研究证明多种植物提取物含有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物活性成分[2-4]。随着植物源活性成分研究的深入，以及“天然”理念在产品设计中的推崇，越来越多的植物源活性成分被应用于牙膏的配方中，如牡丹皮提取物的丹皮酚(Pae)[5]，厚朴提取物中的厚朴酚(Mag)、和厚朴酚(Hon)[6]，甘草的主要成分甘草次酸(Gly)[7]，百里香属植物挥发油的主要成分麝香草酚(Thy)[8]等。此类化合物均为药物成分，具有一定的药性[9]：甘草味甘、性平，但甘草中甘草次酸的结构和作用类似于肾上腺皮质激素，长期滥用会产生身体浮肿、血钠浓度升高等不良反应[10-11]；厚朴、和厚朴酚类虽具有较大的临床功效，但报道显示中药减肥人群中肾功能衰竭与防己、厚朴有关[12]；麝香草酚对HEK293 细胞和Vero细胞的最大无毒浓度分别为62.5 mg/L和50 mg/L[13]。因此，牙膏中过量添加此类药用成分可能有潜在危害。为监控产品质量，保障消费者的健康，亟需建立牙膏中该5种化合物的检测方法。

目前，仅QB/T 2966-2014《功效性牙膏》[14]中规定了丹皮酚的测试方法，牙膏中麝香草酚等其他4种物质尚无标准，该4种物质的相关研究主要集中于胶囊、软膏、药丸、药材、口服液等药物领域，分析方法包括气相色谱法(GC)[15-18]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[19-21]、超临界流体色谱法(SFC)[22]、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[23]、毛细管电泳法(CE)[24]、电化学法[25]、近红外光谱法(NIR)[26-27]及液相色谱法[28-31]。本研究采用超高效液相色谱建立了牙膏中丹皮酚、麝香草酚、和厚朴酚、厚朴酚、甘草次酸5种植物源活性成分的快速测定方法，方法简便、快速、灵敏、准确，可满足牙膏中5种植物源活性成分的检测要求，已成功应用于实际样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪配PDA二极管阵列检测器(美国Waters公司)，Milli-Q 超纯水器(美国Millipore公司)，Allegra 64R centrifuge台式高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)，超声仪(上海Kudos公司)，电子分析天平(精确至0.01 mg和0.1 mg)。标准品：丹皮酚、厚朴酚、和厚朴酚、甘草次酸(纯度98%，上海Nature Standard公司)，麝香草酚(纯度99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)。甲酸(纯度98%,上海阿拉丁试剂有限公司)，乙腈、甲醇(色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司)，其他试剂为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的制备

分别称取丹皮酚、麝香草酚、厚朴酚、和厚朴酚、甘草次酸标准品各0.1 g(精确至0.000 1g)于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为2 000 mg/L 的混合标准储备溶液。准确移取适量标准储备溶液于容量瓶中，用90%(体积分数)甲醇逐级稀释成质量浓度为1、5、10、25、50、75、100 mg/L的混合标准工作溶液，待测。

1.3 样品的提取

称取牙膏样品1 g(精确至0.001 g)于10 mL具塞比色管中，以90%甲醇定容，加入适量石英砂，于涡旋振荡器上振荡混匀，超声提取15 min，静置至室温，经0.22 μm滤膜过滤后，滤液待测。必要时以90%甲醇稀释滤液，备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®HSS C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，流速：0.3 mL/min，进样量：3 μL，柱温：30 ℃。流动相：0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序：0～1.5 min，70%～60% A；1.5～5.5 min，60%～0% A；5.5～6.0 min，0% A；6.0～6.5 min，0%～70% A；6.5～9.0 min，70% A。检测波长：丹皮酚、麝香草酚为275 nm；和厚朴酚、厚朴酚、甘草次酸为250 nm。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

图1 甲醇体积分数对样品加标响应面积的影响Fig.1 Effect of volume fraction of methanol on response area of the sample

2.2 提取溶剂的优化

待测化合物的化学性质各异，且待测化合物作为牙膏的添加成分，与牙膏中其他基础成分(摩擦剂、发泡剂、保湿剂、增稠剂等)间的化学性质不同，因此待测化合物间、待测化合物与牙膏其他基础成分间于不同溶剂中的溶解度均有差异。本文分别考察了不同有机溶剂以及有机溶剂体积分数对加标样品提取效果的影响。

实验考察了不同有机溶剂(甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇、四氢呋喃)对加标样品提取效果的影响，结果表明，以甲醇为溶剂时的提取效率较高，且杂质干扰较小。另考察了甲醇的体积分数对提取效果的影响,由图1可知，当甲醇的体积分数由10%增至90%时，5种化合物的响应值逐渐增大；继续增大甲醇的体积分数，5种化合物的响应值基本不变。由于牙膏的发泡剂成分(如十二烷基硫酸钠、十二酰基肌氨酸钠)、增稠剂成分(如羧甲基纤维素钠、黄原胶)的水溶性较好，为保证牙膏样品在提取溶剂中的分散效果，本文选择90%甲醇为提取溶剂。

2.3 流动相的选择

考察了流动相pH值(2.0、2.8、4.0、5.0、6.0、7.0)对分离效果的影响，结果表明，当pH≥6.0时，甘草次酸的色谱峰变宽，出峰时间逐渐提前。色谱峰变宽可能是由于pH≥6.0时甘草次酸离子化后与固定相残留的硅醇基相互作用增强；出峰时间提前是由于甘草次酸离子化后极性增强，在反相色谱柱中的保留变弱。因此应选择流动相pH<6.0，以避免甘草次酸离子化。由于pH 2.8时丹皮酚、麝香草酚、厚朴酚、和厚朴酚的半峰宽较小，分离度较高，且甘草次酸的峰对称性及分离度满足实验要求，因此采用0.1% 甲酸(pH 2.8)为流动相。

2.4 线性关系、检出限及定量下限

取“1.2”中配制的标准溶液，采用本方法进行测定，其标准溶液的色谱图见图2。以Pae、Thy、Hon、Mag和Gly的质量浓度(X，mg/L)为横坐标，对应的峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。由表1可知，Pae、Thy、Hon和Mag在2～100 mg/L 范围内，Gly在5～100 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.999。采用基质样品加标方法，通过计算其样品加标的响应与背景噪音的比值分别确定方法检出限(S/N≈3)和定量下限(S/N≈10)，得到5种化合物的方法检出限(LOD)为0.2～1.0 mg/kg，定量下限(LOQ)为0.8～3.5 mg/kg(表1)。

CompoundLinear equationLinear range(mg/L)rLOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)PaeY=192 558X+93 8392～1000.999 10.20.8ThyY=830X+16 5432～1000.999 60.51.7HonY=70 734X+47 0292～1000.999 00.51.7MagY=25 366X+31 6202～1000.999 80.51.7GlyY=13 612X+24 7715～1000.999 51.03.5

2.5 回收率与相对标准偏差

为验证该方法对不同基质牙膏的适用性，选取3种不同配方体系的空白牙膏样品——水合硅石(SiO2)、磷酸氢钙(CaHPO3)和碳酸钙(CaCO3)体系，分别加入4个浓度的Pae、Thy、Hon、Mag和Gly混合标准溶液进行加标回收实验。由表2可知，5种化合物在4个加标水平的平均回收率为90.5%～99.4%，相对标准偏差(RSD)为0.7%～5.1%，表明方法具有较高的准确度，且精密度良好。

表2 牙膏中添加5种混合标准溶液的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of toothpaste spiked mixed standard solutions(n=6)

2.6 实际样品的测定

采用本方法对50支市售牙膏样品进行Pae、Thy、Hon、Mag和Gly含量的测定。结果显示，10支牙膏检出Pae，含量为100 ～500 mg/kg；2支牙膏均检出Mag、Hon，Mag含量分别为428、453 mg/kg，Hon含量分别为467、473 mg/kg。

3 结 论

本研究建立了超高效液相色谱同时检测牙膏中5种植物源活性成分的分析方法。样品采用90%甲醇超声提取，保证了在分析测试过程中的提取效率。本方法灵敏度高、重现性好、操作简单、分析快速、准确可靠，可满足牙膏中丹皮酚、麝香草酚、厚朴酚、和厚朴酚、甘草次酸的检测要求。