乌拉尔甘草不同溶剂提取物的美白活性比较研究

曹思瑶，宋 卓，林鑫宇，钟 源，胡冬华

（长春中医药大学，长春 130117）

甘草是常用的大宗药材[1]，在我国历来就有“十方九草”之说[2]。乌拉尔甘草主产于东北、河北、内蒙古、新疆等地区，有清热解毒、补益心脾、可调和药性、具有止咳平喘、缓急止痛之效。现代药理表明甘草具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、保肝、降血糖、调节机体免疫等功效[3]。甘草提取物可以美白肌肤，抵御自由基氧化，且温和、不刺激、安全性高[4]，可广泛应用在化妆品领域。

目前，国内常用的美白剂主要有三种，分别为：化学类、生物类以及天然植物类。化学美白剂具有效果显著，但刺激较大的特点，会给肌肤带来一定的损伤。生物美白剂由于生产周期长、产量低、成本高，无法广泛应用[5]。天然植物类美白剂，尤其是中药提取物类美白成分资源丰富且成分低，同时安全性高，越来越受到关注。

肌肤暗沉、发黑的最主要原因就是黑色素的生成。当肌肤细胞受到如紫外线、恶劣天气、防腐剂等外界刺激时，会产生过量的自由基。外界刺激作用于角质形成细胞后，会使肌肤产生炎症反应，从而激活黑色素形成的关键酶——酪氨酸酶，使黑色素的表达量在炎症部位增加，导致黑色素聚集，加深肌肤颜色[6]。甘草提取物可通过抑制酪氨酸酶的活性和清除过量的自由基，有效阻止黑色素产生、抑制黑色素沉着，从而达到美白效果。故甘草提取物的美白活性可以用对酪氨酸酶的相对抑制率和对DPPH·自由基的清除率的综合评分为评价指标。

甘草提取物在抑制酪氨酸酶活性和清除自由基的基础上，还有抗炎作用，可消除炎性因子，减少黑色素的聚集[7]。同时，甘草提取物中的甘草黄酮类可有效抵御紫外线辐射，减轻因紫外线照射而带来的肌肤损伤[8]。甘草提取物可以从多个方面同时作用，阻止黑色素的生成，使肌肤美白透亮。

本文在传统甘草提取方法的基础上，根据化妆品配方的需求，增加了丙二醇提取法，并运用紫外分光光度计法和高效液相色谱，对三种提取物的美白活性及有效成分进行比较研究。

1 材料

1.1 设备 DF-101型 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市峪英仪器厂；UV-1780型 紫外分光光度计，日本岛津公司；FA2004型 分析天平，上海天美天平仪器有限公司；800电动离心机，江苏省金坛市江南仪器厂；RE-52A型 旋转蒸发仪，上海荣美生化仪器厂；JP-020S型 超声清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；LC-2030 型 高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 药品与试剂 甘草，购于长春市中药店，经长春中医药大学蔡广知老师鉴定为乌拉尔甘草；L-酪氨酸，中国惠世生化试剂有限公司；酪氨酸酶（25 kU）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、甘草苷（纯度≥98%），上海源叶科技有限公司；甘草酸（纯度≥98%），北京百灵威科技有限公司。

2 方法

2.1 甘草三种不同溶剂提取物的制备 1）甘草水提取物采用豆康宁[9]等人的方法。5.0 g甘草粗粉，加入120 mL蒸馏水，99.1℃水浴提取120 min。以3 000 r/min离心3 min，取上清液，过滤，旋蒸浓缩至浸膏。浸膏用40%的丙二醇水溶液[10]溶解，定容至50.0 mL。2）甘草乙醇提取物采用魏宁等[11]方法，略有改动。5.0 g甘草粗粉，加入6倍量55% 的乙醇回流提取3次，1.5 h/次，合并滤液，过滤，旋蒸浓缩至浸膏。浸膏用40%的丙二醇水溶液溶解，定容至50.0 mL。3）甘草丙二醇提取物参考林宇祺[12]的方法，5.0 g甘草粗粉，按料液比1：5加入丙二醇，80.0 ℃水浴提取2 h，趁热过滤，并用丙二醇洗涤残渣两次，定容至20.0 mL，再用蒸馏水将溶液稀释至50.0 mL。

2.2 酪氨酸酶抑制活性的测定 将甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物原液用PBS缓冲液分别稀释，即生药浓度为10.0 mg/mL、20.0 mg/mL、40.0 mg/mL、80.0 mg/mL、100.0 mg/mL。参照张智萍[13]的方法，分别测定样品原液及稀释后的样液对酪氨酸酶的相对抑制作用。按表1所示，用移液枪精准量取T1、T2、T3、T4反应液中的L-酪氨酸、PBS及样液，以0.36 mg/mL的L-酪氨酸为底物，在pH = 6.8，0.4 mol/L的PBS缓冲溶液中加入样液，分别置于4个PE管中，混匀后放入37 ℃恒温水浴锅中恒温10 min，然后在T2、T4中分别加入1 mL的酶活力单位为200 U/mL的酪氨酸酶，恒温10 min后，立即用紫外分光光度计测475 nm处吸光度，分别记为 AT1、AT2、AT3、AT4。将实验重复三次，求相对抑制率的平均值。按公式（I）计算样液对酪氨酸酶活性的相对抑制率（S）：S = [1-（AT4-AT3）/（AT2-AT1）]×100% （I）

式中：AT1、AT2、AT3、AT4分别是反应液T1、T2、T3、T4的吸光度。

2.3 DPPH·自由基清除率的测定 分别吸取甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物原液用40%的丙二醇水溶液稀释，即生药为2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、8.0 mg/mL、10.0 mg/mL。参照于佳[14]的方法，分别精确吸样品溶液 2.0 mL 放入试管中，加入2.0×10.4 mol/L的DPPH·乙醇溶液2.0 mL，摇匀后置于暗处反应30 min，用紫外分光光度计测定其在517 nm处的吸光度值（Ai）；用2.0 mL DPPH·乙醇溶液加等体积的40%丙二醇水溶液为空白对照样，测定其在517 nm处的吸光度值（Ao）；分别用2.0 mL甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物样品溶液加等体积的40%丙二醇水溶液为样品对照，测定其在517 nm处的吸光度值（Ax），以消除样品本身颜色的影响。按公式（II）计算样品对DPPH·自由基清除率（R）：R = [1 -（Ai - Ax）/Ao]×100% （II）

表1 反应液组成

2.4 高效液相色谱法测定甘草酸和甘草苷含量的测定 按照1.2.1甘草不同溶剂提取物的制备方法，将甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物分别过0.22 μm滤膜。精确称取甘草酸标准品81 mg、甘草苷标准品13 mg，用甲醇定容至10 mL，过0.22 μm滤膜，待用。本方法参照2015版药典中规定的HPLC方法测定甘草酸及甘草苷的含量。色谱柱为伊特利C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为：乙腈（B）- 0.05%磷酸（A）；梯度洗脱（表2）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长237 nm；进样量20 μL。

表2 色谱条件

3 结果

3.1 甘草不同溶剂提取物对酪氨酸酶相对抑制作用的比较结果 酪氨酸酶为黑色素形成过程中的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性可分别抑制酪氨酸转化为Dopa和Dopaquinone的过程[15]，从而减少黑色素的生成数量。本部分工作以酪氨酸酶抑制活性为重要考察指标。如图1所示，甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50分别为：91.40 mg/mL、59.76 mg/mL、16.10 mg/mL；其中甘草丙二醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用明显高于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。因甘草水提取物中的甘草多糖已在提取后，用离心操作除去，故甘草水提取物的主要成分为甘草酸和甘草皂苷及少量甘草苷[16]。研究表明甘草酸二铵、甘草皂苷和甘草苷对酪氨酸酶均有抑制作用[17-18]。由于甘草黄酮不易溶于水，但甘草黄酮对酪氨酸酶有一定的抑制作用，故甘草水提取对酪氨酸酶的抑制作用小于甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物。

图1 3种不同溶剂的甘草提取物对酪氨酸酶活性的抑制情况

3.2 甘草不同溶剂提取物对DPPH·自由基的清除作用的比较结果 DPPH·自由基（1，1-二苯基苦基苯肼）检测是通过分子中1个稳定的DPPH自由基接受抗氧化剂提供的1个电子，形成稳定的DPPH-H结构，使DPPH的特征紫色变成黄色或无色，变色程度与抗氧化剂接受的电子数量成定量关系，可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价[19-20]。

图2 3种不同溶剂的甘草提取物对DPPH·的清除能力

如图2所示，甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物对DPPH·自由基清除作用的IC50分别为：14.46 mg/mL、7.16 mg/mL、6.08 mg/mL；其中甘草丙二醇提取物对DPPH·自由基的清除作用明显高于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。由于甘草黄酮可溶于碱水和有机溶剂，所以，溶剂乙醇和丙二醇可以提取出较多的甘草黄酮，而水溶液只能提取出少数种类的甘草黄酮。甘草水提取物中杂质较多，不易过滤，且不易保存，容易产生白色絮状物，使甘草提取物变得粘稠，这些因素可能会影响甘草水提取物对DPPH·自由基的清除作用，故我们的实验研究表明，甘草水提取物应分离纯化后，再应用到化妆品中。

3.3 甘草酸和甘草苷含量的比较分析 用高效液相色谱法，以甘草酸标准品和甘草苷标准品，对生药浓度相同的甘草水提取物、甘草乙醇提取物以及甘草丙二醇提取物中甘草酸和甘草苷含量进行比较分析。甘草苷和甘草酸的保留时间分别为：8.35 min和30.12 min。根据下图可得：甘草丙二醇提取物中甘草苷和甘草酸含量明显高于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。

在提取物甘草有效成分时，乙醇为最常用的有机溶剂。一般认为增加乙醇的浓度有利于甘草总黄酮的提取，由于黄酮类物质结构的影响，高浓度的乙醇适用于提取黄酮苷元类，低浓度乙醇适用于提取黄酮苷类，由此可见甘草黄酮的提取效果受溶剂极性影响较大[21]。基于溶剂极性的考虑，我们系统实验研究表明，丙二醇可以作为提取甘草有效成分的优良溶剂。对三种提取物的HPLC图进行比较分析，结果表明甘草丙二醇提取物中甘草苷和甘草酸的含量较多，甘草乙醇提取物和甘草水提物中甘草苷和甘草酸的含量相差不大；实验发现，甘草丙二醇提取物和甘草乙醇提取物HPLC图中在保留时间16 min～22 min时，出现甘草水提取物没有的色谱峰。参照谢佳颖[22]等人的研究，推测其中含有异甘草素葡萄糖芹菜苷和异甘草苷，且甘草丙二醇提取物中这两种物质的含量也明显高于甘草乙醇提取物，进一步研究工作正在进行中。

图3 甘草酸标准品和甘草苷标准品的HPLC图

图4 甘草丙二醇提取物的HPLC图

图5 甘草乙醇提取物的HPLC图

图6 甘草水提取物的HPLC图

4 小结

本工作为科学合理地研究开发中药乌拉尔甘草有效成分在化妆品中的应用提供了重要实验依据。通过测定甘草不同溶剂提取物对酪氨酸酶相对抑制作用和对DPPH·自由基的清除率，综合比较了甘草不同溶剂提取物的美白活性。研究结果表明，无论是对酪氨酸酶的抑制作用还是对DPPH·自由基的清除作用，甘草丙二醇提取物都表现出突出的优势；甘草丙二醇提取物的美白活性明显优于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。经HPLC分析检测结果表明，甘草丙二醇提取物中甘草苷和甘草酸的含量也明显高于乙醇提取物和水提取物。本论文研究工作探索了丙二醇这一优良的提取溶剂，为甘草有效成分的提取提供了一种新途径，也为甘草丙二醇提取物在美白化妆品中的应用提供了重要的支持和参考。