全血中4种新型合成大麻素的快速检测

徐恩宇，张云峰，宋歌，蒋锐，刘光琴，刘俊亭

（1.中国医科大学法医毒物分析教研室，辽宁 沈阳 110122；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038）

合成大麻素类（synthetic cannabinoid，SC）新型策划药是人工合成的内源性大麻素受体1（cannabinoid receptor 1，CB1）和CB2 受体激动剂[1]，经化学结构修饰降低分子极性以增强血脑屏障通过能力，只需要很低的浓度就能产生比天然大麻更强的效力。1-戊基-3-（2-氯苯乙酰基）吲哚［2-（2-chlorophenyl）-1-（1-pentyl-1H-indol-3-yl）ethanone，JWH-203］、1-戊基-3-（4-甲基-1-萘甲酰基）吲哚［（1-pentyl-1H-in⁃dol-3-yl）（4-methylnaphthalen-1-yl）methanone，JWH-122］、N-（1-金刚烷基）-1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰胺［N-（1-adamantyl）-1-（5-fluoropentyl）-1H-indazole-3-carboxamide，5F-APINACA］、N-（1-氨甲酰基-2-甲基丙基）-1-（环己基甲基）吲唑-3-甲酰胺［N-（1-amino-3-methyl-1-oxobutan-2-yl）-1-（cyclohexylmethyl）-1H-indazole-3-carboxamide，ABCHMINACA］作为国内发现的合成大麻素的典型，已于2015年10月被我国列为第一类精神药品加以管制[2]。合成大麻素类种类繁多且更新速度极快，在生物样品如血液中浓度低，检测时限短，难以检测[3-5]，在常规毒物筛查中多为阴性，目前检测方法报道不多，基于红外光谱、色谱-质谱联用和高分辨质谱技术是鉴定此类未知物的有效手段。

为满足鉴定工作的需要，本研究联合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术分析检材中的合成大麻素，建立准确、快速的检测方法，并提供4种合成大麻素的质谱解析信息，结合分子结构、色谱行为和CB1受体亲和力信息推测未知合成大麻素的精神活性作用，为此类物质的鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1260-6420三重串联四极杆液质联用仪、7890B-5977A气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司），SPD1010P1-230离心浓缩系统、SorvallTMLegendTMMicro 21R微量离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），Lab Dancer振荡器（德国IKA公司），Simplicity 185超纯水系统（美国Millipore公司）。

乙腈、甲醇和甲酸（HPLC级，美国Sigma-Aldrich公司），AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA、JWH-122对照品由公安部禁毒局国家毒品实验室制备。

空白全血样品采自健康受试志愿者。

1.2 溶液配制

用甲醇分别配制对照品（JWH-203、JWH-122、5FAPINACA和AB-CHMINACA）质量浓度为1mg/mL的储备液，置于-20℃保存。本实验中所用其他质量浓度的工作液均由上述储备液经甲醇稀释获得。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 GC-MS条件

色谱柱为HP-5MS毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm，美国 Agilent公司）。程序升温：初始柱温60℃，保持1 min，以20℃/min升至300℃，保持12min。氦载气流量0.56mL/min，进样口温度265℃，离子源温度230℃，检测器温度150℃。结合美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）14谱库进行筛选。

1.3.2 LC-MS/MS条件

色谱柱为ZORBAX SB C18色谱柱（2.1mm×50mm，1.8μm，美国Agilent公司）。流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈，两者体积比为3∶7；流速0.20mL/min；进样体积1 μL；采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正离子模式；干燥气温度350℃；干燥气流速12 L/min；雾化器压力45 psi；采用子离子（product ion）扫描模式进行定性分析，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行定量分析，驻留时间为150ms。

1.4 样品前处理

精密吸取全血样品200 μL于2 mL离心管中，加入600μL乙腈，超声1min，以17500×g离心3min，上清液经离心浓缩后挥干，经50μL甲醇复溶进样。

1.5 方法学验证

工作曲线、检出限（detection limit，LOD）和定量限（quantification limit，LOQ）：取空白血液200μL，添加适量的JWH-203、JWH-122、5F-APINACA和ABCHMINACA对照品标准溶液，分别配制成质量浓度为0.1、0.5、1、10、50、100、250、1 000 ng/mL 的校准样品，按照1.4节方法进行样品前处理，按1.3节色谱与质谱条件进样分析。分别以4种目标物的添加质量浓度为自变量（x，ng/mL）、第一组母离子/子离子对的峰面积为因变量（y）进行线性回归，以信噪比（S/N）=3确定LOD，S/N=10确定LOQ。

回收率、基质效应和精密度：在空白血液中分别添加4种对照品标准溶液，分别配制成高、中、低质量浓度（分别为250、50、5 ng/mL）的血样，并按照1.4节方法进行样品前处理，按1.3节色谱与质谱条件进样分析。血样按1.4节方法处理后，将进样的峰面积设为A；空白样品按1.4节方法处理后，加入相应质量浓度的对照品溶液，将进样后的峰面积设为B；将对照品溶液吹干复溶后进样的峰面积设为C。提取回收率为A/B×100%，基质效应为B/C×100%。连续3d在同一时间分别对4种目标物高、中、低质量浓度进行检测，计算日间精密度，以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

2 结 果

2.1 GC-MS分析

血液中4种目标物在选定的GC-MS条件下需要21 min完成分析，色谱行为良好，总离子流色谱图见图 1。JWH-203、AB-CHMINACA、5F-APINACA 和JWH-122的提取离子分别为m/z214、m/z241、m/z233、m/z355，保留时间分别为16.0、17.2、19.3、20.7min。

图1 全血中4种合成大麻素的GC-MS总离子流图

4种目标物的提取离子色谱图（extracted ion chro⁃matogram，EIC）经NIST 14谱库检索得到相应的质谱信息，JWH-203、5F-APINACA和JWH-122均能匹配谱库中的结构式信息，但AB-CHMINACA未检索到相应的质谱信息，特征碎片离子为m/z312.3、m/z241.2、m/z145.1。

2.2 LC-MS/MS分析

血液中4种目标物在选定的LC-MS/MS条件下仅需5min即完成分析，色谱行为良好，AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122的保留时间分别为1.17、2.24、3.07、3.68min（图2）。

图2 全血中4种合成大麻素的LC-MS子离子色谱图

先对4种合成大麻素的碰撞诱导解离电压优化（优化的质谱参数见表1），使前体离子产生最强信号，再选取质子化分子作为前体离子，获得各种碰撞能量下的裂解信息（图3）。

表1 全血中4种合成大麻素的质谱参数

图3 全血中4种合成大麻素的LC-MS质谱信息

2.3 方法学验证

4种目标物的线性回归方程、LOD及LOQ见表2，回收率、基质效应和精密度见表3。AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122在1～250 ng/mL质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）＞0.99，LOD为0.1～0.5 ng/mL，提取回收率为85.4%～95.2%，基质效应为80.3%～92.8%，日间精密度小于10.0%，说明该方法适用于血液中痕量合成大麻素的检测。

表2 全血中4种合成大麻素的LOD、LOQ和线性范围

表3 全血中4种合成大麻素的回收率、基质效应和日间精密度 （%）

3 讨 论

本研究先应用GC-MS法对全血添加样品进行初步检测，呈阳性结果的再应用LC-MS/MS法进行确认，经建立的快速检测方法得到4种合成大麻素的色谱行为和质谱解析信息，可为禁毒工作提供参考。在选定的GC-MS条件下，AB-CHMINACA在NIST 14谱库中无信息，特征碎片离子为m/z312.3、m/z241.2、m/z145.1，与文献[6-7]一致。在选定的LC-MS/MS条件下，AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122目标物的特征碎片明显区分，与文献[5，8-11]一致。

本研究GC-MS法的保留时间中，JWH-203＜ABCHMINACA＜5F-APINACA＜JWH-122，而LC-MS/MS法的保留时间中，AB-CHMINACA＜JWH-203＜5FAPINACA＜JWH-122，提示合成大麻素JWH-203和AB-CHMINACA在不同的色谱条件下保留行为具有不一致性[12]。不同化合物在毛细管柱中的出峰顺序主要取决于相对分子质量和沸点大小，目标物的相对分子质量JWH-203＜AB-CHMINACA＜5F-APINACA，与出峰顺序一致；JWH-122相对分子质量较小但出峰慢，可能与其分子结构中的萘环有关，沸点较高，保留时间长。

合成大麻素的精神活性作用与CB1的亲和性相关，亲和力K1值越低，对受体的亲和力越高。4种合成大麻素与CB1的亲和力K1值为AB-CHMINACA［（0.78±0.11）nmol/L］＜5F-APINACA［（1.94±0.55）nmol/L］和 JWH-122［（0.69±0.05）nmol/L］＜JWH-203［（8.0±0.9）nmol/L］[1，13-14]。5F-APINACA 和 AB-CHMINACA属于较新的第8代吲唑酰胺类合成大麻素，分别于2013年和2015年成为德国、美国和中国等国家管制药物，再结合液相色谱保留时间和K1值可推测：第8代吲唑酰胺类合成大麻素中，较新的AB-CHMINACA比5F-APINACA的精神活性作用更强（K1值低）、极性较大（保留时间短）。总体可以看出，新型合成大麻素的发展趋势为精神活性作用更强、使用剂量更低、检测难度更大。