白桦反义CCoAOMT基因调控木质素生物合成

姚连梅 胡晓晴 周 菲 郑要强 王国东 刘雪梅

(1.东北林业大学,哈尔滨 150040； 2.黑龙江省农业科学院经济作物所,哈尔滨 150040)

木质素为芳香族聚合物，是植物体中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质，主要存在于次生加厚的植物细胞壁中，可为植物提供机械支持，保护植物免受真菌入侵。而由于木质素结构的稳定性，使其难以消化和降解。在造纸行业中，需要使用有毒且昂贵的化学药品将木质素从纤维素和半纤维素中分离。近几十年的研究已阐明了木质素单体的主要生物合成路线，并且通过木质素调控能够提高木本植物的制浆率和草料的可消化性等[1]。

参与木质素生物合成途径的酶有十多种，其中咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的一种关键酶，主要催化羟基辅酶A酯的甲基化反应，将咖啡酰辅酶A转化成阿魏酰辅酶A[2]。目前已在烟草[3～4]、棉花[5]、蓿苜[6]、杨树[7～11]等多种植物中克隆了CCoAOMT基因。在下调CCoAOMT的转基因烟草中发现木质素含量下降的同时，纤维素含量有所增加，这说明转基因植株中木质素和纤维素的合成存在着互相补偿关系[3]。在下调CCoAOMT的转基因蓿苜中木质素结构发生了变化，G型和S型木质素单体的合成也受到了影响[6]。在Chen等的进一步研究中发现，在蓿苜中抑制CCoAOMT基因会使木质素的含量下降，其中G型单体显著减小，而S型单体没有发生变化[6]。赵华燕等利用转化反义CCoAOMT基因培育了低木质素的毛白杨[8]，这种转基因杨树表现出优质的制浆性能，木质素更易于去除、制浆得率和纤维聚合度都得到提高[9]。

白桦是我国北方重要的造林树种，具有较高的经济价值，其材质优良，是适于造纸的好材料。本研究以白桦为试材，构建了反义CCoAOMT植物表达载体，并将其转化至白桦中，对转基因植株进行了分子检测后进行了组织化学染色及化学成分分析。本文为研究CCoAOMT基因在白桦中的作用及培育低木质素含量的新品种白桦奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

转基因的受体材料为东北林业大学栽植的白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)组培苗。用于化学成分分析和纤维形态检测的材料为田间种植的7年生野生型和反义表达CCoAOMT转基因白桦的7个株系，共89株。

载体、菌株及试剂：植物表达载体pBI121、根癌农杆菌EHA105为本实验室保存;pMD18-T载体购于宝生物工程有限公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司；引物合成公司为北京华大基因科技有限公司；普通Taq酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；T4连接酶、限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ均购自NEB公司。

1.2 基因克隆

利用CTAB法提取20年生白桦次生木质部RNA，反转录合成cDNA。通过对NCBI已分离的欧芹、茄属和烟草等植物的CCoAOMTcDNA保守序列比较和分析，设计简并引物,F：5′-AGCGATGCYCTYTAYCAGTA-3′，R：5′-TTCCABAGVGTGTTGTCGTA-3′，通过RT-PCR获得白桦CCoAOMT部分序列。根据保守序列结果，设计3′RACE特异性引物5′-TCGTGGACGCTGACAAGGACAACT-3′；5′RACE特异性引物5′-GAGCCATGGTTCTTCTCATCTGC-3′；使用上述引物PCR获得CCoAOMT基因各片段及全长。将pMD18-T连接的白桦CCoAOMT全长cDNA质粒命名为pTXB。

1.3 植物反义表达载体构建

将CCoAOMT全长cDNA反向连接至pBI121载体作为植物反义表达载体。分别提取pTXB、pBI121质粒，选择pTXB和pBI121上的共有酶切位点XbaⅠ、BamHⅠ对上述质粒分别进行双酶切。反应程序为：37℃ 3 h，65℃ 20 min。白桦CCoAOMT基因与pBI121载体经过回收后，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒进行PCR检测。检测引物为F:ATGGCTACCAACGGAGAAG;R:TTTGATCCGACGGCAGAGA；PCR反应条件：94℃，5 min；94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，45 s；35个循环后72℃ 7 min。将经PCR检测和测序的植物反义表达载体质粒转入到农杆菌EHA105中，PCR鉴定无误后可用于后续实验。

1.3.1农杆菌介导的遗传转化和转基因白桦的再生

(1)工程菌的制备：平板上挑取EHA105菌株的单菌落，接种到20 mL含有卡那霉素(50 mg·L-1)和利福平(50 mg·L-1)的LB培养基中，于28℃恒温摇床中培养至OD600为0.6～1.0。用WPM液体培养基将菌液稀释至OD600为0.2～0.3用于转化；

(2)外植体预培养：取培养20 d白桦无菌苗，将其叶片(剪成0.5 cm×0.5 cm～1 cm×1 cm的小块)和茎段(1 cm左右)接种到分化培养基上，黑暗预培养1～3 d；

(3)菌液侵染：在超净工作台内，将菌液倒入无菌的小烧杯中。取出预培养的外植体，放入菌液，轻轻摇晃，侵染30 min；

(4)共培养：将叶片和茎段从菌液中取出，于无菌滤纸上吸取多余的菌液，并接种在无抗生素的愈伤诱导培养基(WPM+BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)上共培养2～4 d；

(5)选择培养：将经过共培养的外植体转移到含有卡那霉素(50 mg·L-1)和头孢抑菌剂(200 mg·L-1)的愈伤诱导培养基上，25℃条件下，进行选择培养；

(6)继代选择培养：选择培养3～4周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入含有卡那霉素(50 mg·L-1)和头孢抑菌剂(200 mg·L-1)的分化培养基(WPM+BA 0.5 mg·L-1)上诱导分化；

(7)生根培养：待不定芽长到l cm以上时，切下并插入加有卡那霉素(50 mg·L-1)和头孢抑菌剂(200 mg·L-1)的生根培养基(WPM+IBA 0.4 mg·L-1)上进行生根培养。

1.4 转化植株的分子检测

基因组水平检测：随机选取在卡那霉素中生根的抗性11个转基因株系，采用CTAB法分别提取叶片总DNA作为模板，以CCoAOMT基因全长引物进行PCR扩增。阳性对照的模板为抑制表达重组载体质粒，阴性对照为野生型白桦。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析并照相。

表达水平检测：以DNA水平检测为阳性的7个株系和非转基因白桦叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA。按照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit(TOYOBO,Japan)试剂盒说明书反转录合成cDNA。以7个转基因株系和野生型cDNA为模板，白桦肌动蛋白actin作为内参基因进行RT-PCR检测，检测引物如下。内参基因引物为F:5′-CATCTCTGATCGGAATGGAAG-3′，R:5′-AGATCCTTTCTGATATCCACG-3′；BpCCoAOMT引物为F:5′-TGGCCATGGACATCAACAGA-3′,R:5′-AGGAGGCGCCACGACAGAG-3′。

1.5 转基因白桦的组织化学检测

分别取培养25 d的组培苗茎基部的野生型和转基因白桦的新鲜茎段，使用冷冻切片机Leica CM1800进行切片。对横切的20 μm厚的薄片组织进行Wiesner反应：将薄片置载玻片上，先加一滴1%的间苯三酚，后加2%盐酸。盖上盖玻片，数秒后即可显色。在显微镜下观察，拍照。

1.6 转基因白桦的原料化学组分测定

取4个7年生转基因株系与对照野生型各5株，去掉直径15 mm以上树冠及枝丫材后切片风干备用。原料化学组分主要进行水分、1%氢氧化钠抽出物、有机溶剂抽出物、木素、综纤维素和多戊糖测定。原料水分测定采用GB/T2677.2-93造纸原料水分的测定方法进行；1%氢氧化钠抽出物测定采用GB/T2677.5-93造纸原料1%氢氧化钠抽出物含量的测定方法进行；苯醇抽出物测定采用GB/T2677.6-94造纸原料有机溶剂抽出物含量的测定方法进行；热水抽出物测定采用GB/T2677.2-1993造纸原料水分含量测定方法进行；木素测定采用GB/T2677.8-94造纸原料酸不溶木素含量的测定方法进行；综纤维素测定采用GB/T2677.10-1995造纸原料综纤维素含量的测定方法进行；多戊糖测定采用GB/T2677.9-94造纸原料多戊糖含量的测定方法进行。

2 实验结果

2.1 白桦CCoAOMT基因cDNA全长序列的获得

利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术，对CCoAOMT基因cDNA片段分别进行5′端和3′端序列的扩增，电泳结果见图1A～B。将所得序列用NCBI BLASTN和BLASTP以及DNA分析软件分析，确定获得白桦CCoAOMT基因全长序列，序列全长为744 bp(图1C)。已在Genbank上注册，CCoAOMTcDNA注册号为AY860952。

2.2 反义表达载体的构建

如图2A所示，分别将目的片段和植物表达载体pBI121进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，回收纯化的目的片段和植物表达载体通过T4DNA连接酶过夜连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，经抗性筛选和菌落PCR检测获得阳性克隆，提取阳性重组质粒DNA，进行PCR鉴定，扩增出约750 bp左右的特异性条带，扩增结果如图2B所示。经过测序比对，CCoAOMT全长cDNA确实是按照设计反向插入在预定的位点，与预期结果完全相符。将上述重组质粒转化到农杆菌，得到阳性克隆后提取质粒进行PCR检测，扩增结果同图2B。获得重组植物表达载体，命名为pBI121-antiCCoAOMT。

2.3 抗性转基因植株的获得

将构建好的农杆菌植物表达载体pBI121-antiCCoAOMT利用农杆菌介导法分别侵染白桦叶片和茎段。通过试验白桦对抑菌剂和卡那霉素浓度的敏感性，本研究最终选择筛选剂卡那霉素浓度为40 mg·L-1。抑菌剂羧苄青霉素浓度为400 mg·L-1。转基因的大致过程如图3所示，图3A为侵染25 d后在卡那霉素筛选下叶脉伤口产生的愈伤。继续经卡那霉素筛选，最终获得11个绿色抗性芽点，图3C为筛选出的抗性外植体。图3D为经过PCR检测的阳性植株经过再分化后在卡那霉素的生根培养。

图1 BpCCoAOMT cDNA的获得 A. 3′末端扩增产物;B. 5′末端扩增产物;C. BpCCoAOMT cDNA扩增产物Fig.1 Cloning of BpCCoAOMT cDNA A. 3′sequence of CCoAOMT from B.platyphylla; B. 5′sequence of BpCCoAOMT; C. PCR detection of CCoAOMT cDNA(M. 1 kB ladder)

图2 白桦CCoAOMT基因植物反义表达载体构建 A. pBI121-antiCCoAOMT意图；B. pBI121-antiCCoAOMT的PCR扩增检测(1～2.pBI121-antiCCoAOMT;3.DL2000分子量标准) Fig.2 Construction of antisense expression vectors of CCoAOMT gene in B.platyphylla A. Schematic representation of pBI121-antiCCoAOMT constructs; B. Identification of pBI121-antiCCoAOMT by PCR(1-2. pBI121-antiCCoAOMT; 3. DL2000 DNA maker)

图3 转化植株的愈伤诱导、分化及生根 A.叶片愈伤组织；B.茎段愈伤组织；C.愈伤组织诱导的丛生芽；D.移栽成活的再生植株Fig.3 Complete process of the genetic transformation of birch A. Callus of the leaves; B. Callus of the stems; C. Buds differentiating from callus; D. Transplanting survival of regeneration plants

图4 对部分Kan抗性植株的PCR检测 +.阳性对照(pBPCOA质粒)；-.阴性对照(未转化植株)；1～11.转基因株系；M.DL2000标准分子量Fig.4 PCR detection of the selective Kan resistant plants +. Positive control(pBPCOAplasmid); -. Negative control(wild type birch); 1-11. Transgenic lines; M. DL2000 DNA maker

2.4 转化白桦的检测和分析

2.4.1 转基因白桦DNA水平的PCR检测结果

将获得的11个卡那霉素抗性株系进行PCR扩增检测，部分扩增结果见图4，其中7个株系在744 bp左右处有单一扩增谱带，而阴性对照未见扩增谱带，初步证明CCoAOMT基因已经整合到这7个株系的基因组中，将7个转基因株系通过分化生根PCR检测，最终获得转CCoAOMT基因抗性植株共89株。

2.4.2 转基因白桦的RT-PCR检测结果

选取上述7个株系的转基因白桦和野生型的新鲜叶片，提取白桦总RNA，凝胶电泳结果见图5，RNA样品无降解无杂质，可以用于后续实验。将上述RNA样品反转录合成cDNA，以新合成的cDNA为模板，用内参actin引物检测cDNA模板量。在所有样品的cDNA模板量基本相同的情况下，用白桦CCoAOMT基因的特异性引物进行PCR扩增。如图5所示，转基因白桦CCoAOMT基因的表达量明显低于野生型，说明在转入反义CCoAOMT基因后，白桦中的CCoAOMT基因表达受到一定程度的抑制。

图5 RT-PCR检测转基因白桦中內源CCoAOMT基因的表达 上为野生型与转基因株系的RNA；中为actin扩增产物；下为内源CCoAOMT基因的RT-PCR产物；WT.野生型对照；1～7.转基因株系Fig.5 The expression of endogenous CCoAOMT in transgenic birch by RT-PCR The up panel means RNA of wild type and transgenic lines,and the middle panel indicated the PCR production of actin.The bottom part means the RT-PCR production of endogenous CCoAOMT; WT. Wild type of birch; 1-7. Transgenic lines

2.5 木质素的组织化学染色

为研究CCoAOMT反义表达后对木质素含量的影响，利用Wiesner染色法对转基因株系的茎切片进行染色。Wiesner主要与木质素中的羟基肉桂醛和苯甲醛反应，该试剂对木质素中松柏醛产生特异性反应，其染色强度可粗略反映木质素含量。随机选取不同株系的转基因白桦进行Wiesner染色，结果显示与野生型相比，反义表达CCoAOMT基因植株木质化细胞染色相比野生型染色均变浅，其中4号株系表现最为明显(图6)，表明反义转化CCoAOMT基因后木质素含量有所下降。

2.6 化学成分分析

对4个反义转化CCoAOMT基因的转基因白桦株系和野生型对照进行化学成分分析(表1)，结果表明，反义转化株系的原料水分、综纤维素含量、1%氢氧化钠抽提物含量没有明显差别。反义表达4号株系的苯醇抽提物明显低于对照组，其中苯醇抽提物的主要成分是树脂、蜡质、脂肪和其他水溶性物，其较高的含量是不利于制浆造纸的，而4号株系中较低的苯醇抽提物说明其是有利于造纸的。聚戊糖是半纤维素中五碳糖组成的高聚物的总称。转基因1、3、7号株系的聚戊糖含量显著升高暗示着抑制CCoAOMT基因表达会引起半纤维素含量升高。值得注意得是，4个转基因株系的酸不溶木质素(亦称Klason木素)含量在12.18%～12.65%，而野生型为16.72%，转基因株系的木质素明显下降。

表1 化学成分测定结果

*P<0.05；**P<0.01

图6 转基因白桦组织化学染色 A.野生型；B.反义CCoAOMT转基因白桦4号株系Fig.6 The histochemical stain of transgenic birch A.Wild type; B.Line 4 of Anti CCoAOMT transgenic white birch

3 讨论

研究表明在绝大多数植物中，木质素合成途径是十分保守的[9]。利用基因工程手段下调参与木质素合成途径的基因，可有效降低木质素含量。木质素既可改善胶粘剂的性质，又可节约苯酚的用量[10]。CCoAOMT基因是调控木质素合成过程中的关键酶基因。研究表明，咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶由多基因编码，例如，水稻中有9个CCoAOMT基因家族成员，白杨中存在6个CCoAOMT基因家族成员，而拟南芥中多达11个CCoAOMT基因[12～14]。本文利用RACE技术首次得到了白桦长为744 bp的BpCCoAOMTcDNA序列，将其反向连接至35S驱动的pBI121植物表达载体，利用农杆菌侵染法转入白桦。转基因茎段切片Wiesner染色和化学成分分析表明抑制BpCCoAOMT基因后，白桦木质素含量明显下降。这与王玲[4]等将美洲黑杨CCoAOMTcDNA反义转化至烟草中，转基因株系的木质素含量最多下降了9.2%的结果一致。在白桦中的CCoAOMT反义表达导致木质素含量降低，并且对转基因植物早期生长阶段及其内部机械疏导系统基本没有影响，暗示植物中残余的木质素可能足以维持植物正常的生理活动及其细胞原有结构，或者当木质素合成途径受到干扰时，可能刺激植物产生相应的应激反应，这与赵华燕[8]等将反义CCoAOMT基因整合到毛白杨基因组中结果一致。魏建华[15]等研究表明反义表达CCoAOMT的转基因杨树的木质素含量比野生型下降了13%，G/S略有增加、纤维品质也有所提高。Wagner[16]等发现在辐射松中抑制CCoAOMT后，木质素含量和结构均有所改变。除了明显的木质素下降，本研究发现下调CCoAOMT后表现出较高的半纤维素含量和较低的苯醇抽提物。半纤维素的增加有利于纸张强度，而较低的苯醇抽提物也是有利于制浆的。总之，我们的结果证实了CCoAOMT参与木质素的合成，反义CCoAOMT能有效的可利用CCoAOMT调控木质素合成途径。总之，CCoAOMTcDNA是木质素生物合成的遗传操作的理想靶标，为培育低木质素含量的制浆新品种白桦奠定基础[17～18]。

反义RNA与靶RNA具有互补序列，通过与靶RNA进行碱基互补配对，进而影响mRNA前体拼接、转移以及5′和3′端修饰等[19～20]。反义RNA参与植物基因表达的调控，抑制靶基因表达，现已广泛用于植物基因工程。本文利用反义RNA技术，有效地降低了CCoAOMT基因在白桦中的表达。近年来，利用Cas9/gRNA技术实现基因编辑的研究受到全球的瞩目[21]，未来有望利用该技术进一步研究白桦CCoAOMT基因功能。