一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法的研究

郑朝朝,刘云涛,李倬,邹立宏,郁宏伟*

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司，河北保定071000；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定071000；3.吉林省进出口检验检疫局，长春130062）

猪瘟病毒和猪瘟疫苗效力检验主要依靠兔体定型热反应方法（RID）[1]，试验成本较高、操作繁琐、试验周期较长，且受实验动物个体差异和环境因素等多方面影响，检测结果不够准确，造成疫苗成品质量不稳定[2－3]，甚至免疫失败。

相关文献中有很多关于免疫荧光检测法（FA）[4]、酶联免疫吸附法（ELISA）[5－6]、聚合酶链式反应法（PCR）[7]和实时荧光定量PCR法（Realtime PCR）[8－9]等检测猪瘟活疫苗效力的报道[10]，但都有各自的缺陷，如不能有效区分活病毒与失活病毒、重复性差、操作复杂等，最终未能全面推广。本研究建立了一种快速、准确、稳定检测猪瘟病毒含量及疫苗效力的间接免疫荧光法（IFA），以便能更加准确评价猪瘟活疫苗效力和猪瘟半成品病毒含量，满足规模化生产的需求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 猪瘟抗体阳性血清（一抗），购自中国兽医药品监察所，批号2009002；FITC标记的兔抗猪荧光抗体（二抗），购自SIGMA公司，批号2015002；甲醇、丙酮、PB、氯化钾、氯化钠等试剂，均为分析纯，购自北京益利化学试剂公司。

1.1.2 细胞 猪睾丸细胞（ST），由瑞普（保定）生物药业有限公司种毒室提供。

1.1.3 样品 瑞普（保定）生物药业有限公司2013－2014年生产的猪瘟活疫苗成品20批、半成品90批。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏、培养 常规方法复苏ST细胞，培养至细胞长成良好单层后用0.25%胰酶消化分散，并用细胞生长液重悬，接种于96孔细胞培养板，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h，备用。

1.2.2 效价检测

1.2.2.1 兔体定型热反应检测 按照国标中猪瘟活疫苗效力检验方法对被检疫苗进行稀释，用RID法检测被检样品的效力。

1.2.2.2 荧光检测 倍比稀释各被检样品，制备成不同稀释度的病毒液备用。弃去96孔板内细胞生长液，用0.01 mol/L的PBS冲洗一遍后将0.1 mL病毒液与PB液（1∶1）混匀加入96孔培养板，每个稀释度设6个复孔。同时设置不加PB液的对照孔及阴性、阳性对照孔。接毒后细胞培养板置于37℃孵育2.5 h，孵育结束后弃去病毒液，用0.01 mol/L的PBS冲洗一遍，补充维持液继续培养3 d，采用IFA法检测样品的TCID50。

1.2.3 重复性试验 随机抽取猪瘟活疫苗成品、半成品样品各5批次，应用本研究中建立的检测方法和RID法进行效力检测，均重复两次，统计检测结果。

2 结果与分析

2.1 与常规荧光检测方法对比 本研究中IFA法检测猪瘟病毒效力时加入了PB，明显提高了猪瘟病毒对细胞的感染率:本法中样品稀释16000倍接种96孔细胞培养板，培养3 d后，特异性荧光孔数多，单孔荧光广泛（图1），较常规免疫荧光法（图2）明显提高。PB单独处理空白细胞不会产生特异性荧光（图 3）。

图1 本研究IFA检测结果Fig 1 Results of IFA detection by this method

图2 常规FA检测结果Fig 2 Conventional FA detection results

图3 PB处理空白细胞IFA结果Fig 3 IFA results of blank cells treated with PB

2.2 与兔体定型热反应检测法的相关性 通过对20个猪瘟活疫苗成品、90个猪瘟活疫苗半成品的效力检测结果进行统计得出了IFA法与RID法对应关系图（图4和图5）。

图4显示，兔体检测7500 RID/mL的样品，荧光检测TCID50/0.1mL集中在28.8以上；兔体检测1.5×104RID/mL的样品 TCID50/0.1mL集中在28.8至29.8之间；兔体检测3.0×104RID/mL的样品TCID50/0.1mL集中在29.7以上。

图5表明，兔体检测1.0×105～3.0×105RID/mL的半成品样品，TCID50/0.1mL集中在212.11以上，3.0×105～5.0×105RID/mL样品TCID50/0.1mL集中在213.03至213.96；兔体检测5.0×105～8.0×105RID/mL样品，荧光检测 TCID50/0.1mL集中在213.34至214.46；兔体检测8.0×105RID/mL以上合格样品，荧光检测TCID50/0.1mL集中在214.4以上。

图4 成品检测结果Fig 4 Results of product

图5 半成品检测结果Fig 5 Results of Semi-finished product

2.3 重复性试验结果 应用本研究IFA法和RID法分别对猪瘟活疫苗成品、半成品进行效力检测，统计两次检测结果见表1和表2。

表1 两种方法检测成品结果比较Tab 1 Results of product by two detection methods

表2 两种方法检测半成品结果比较Tab 2 Results of Semi-finished product by two detection methods

如表1所示，用IFA和RID两种效力检测方法对5个批次的成品进行复核检验，IFA法两次结果复核率为100%，而RID法两次结果复核率为80%。

如表2所示，用IFA和RID两种效力检测方法对5个批次的半成品进行复核检验，IFA法两次结果复核率为100%，而 RID法两次结果复核率为73%。

3 讨论与结论

通过上述实验结果可以看出，本研究中所建立的IFA法与RID法有良好的对应关系，能够准确、快速检测猪瘟疫苗成品、半成品效力。

本研究所建立的IFA法较常规免疫荧光法敏感性更高，通过在病毒液中增加促细胞感染剂PB定向增加猪瘟病毒与寄主细胞接触面积，从而提高了病毒对细胞的感染率，提高了疫苗检测的敏感性。解决了常规免疫荧光法因细胞感染率不高所导致的不稳定、重复性差的问题，同时避免了RID法中因兔体差异、环境因素、操作繁复所造成的误差。

本研究中IFA法的建立是以RID法为基础，而检测准确度、可重复性高于RID法。如RID法检测140703批成品疫苗时，出现了7500 RID/mL两次检测均不合格，而1.5×104、3.0×104RID/mL检测均合格的情况；检测半成品疫苗时，也多次出现了低倍数稀释半成品疫苗效力检验不合格，而高倍数稀释效力检验合格的情况。而IFA法检测结果更为准确，两次检测结果复核率可达到100%。

本研究将IFA法应用于检测猪瘟活疫苗成品、半成品效力，理论上来说其检测结果（TCID50）与疫苗效力应当有良好的直线对应关系，但实际成品检测结果各检测梯度间TCID50相差不大，而半成品检测结果中相邻的检测梯度间也有较大的重叠区，这可能是RID法检测各样品时并未检测至终点（疫苗实际效力高于检测值），导致与之对应的TCID50偏高。因此本研究仍需要更多数据建立IFA检测结果与疫苗实际效力的直线对应关系，进一步提高检测的准确性。