白头翁口服液质量标准研究

张 璐,龚旭昊,董玲玲,戴 青,范 强

（中国兽医药品监察所，北京100081）

白头翁口服液由白头翁、黄连、秦皮、黄柏4味药组成，具有清热解毒，凉血止痢的功效[1]，市场上生产企业众多。白头翁口服液现行质量标准载于《兽药质量标准》（2017年版中药卷）。其中黄连及盐酸小檗碱的薄层色谱鉴别中，黄连对照药材提取过程较为复杂，且展开剂中含有致癌物苯，对人体伤害较大。处方中君药黄连起主要药效作用且价格较贵，为避免某些企业因节约成本不投、少投、投劣质黄连，选择黄连中关键指标盐酸巴马汀和盐酸小檗碱为含量测定成分[2]，建立高效液相色谱法。通过对标准的有效提高，规范白头翁口服液质量，力求对动物疫病防控起到积极的推动作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2998 PDA检测器，Empower色谱工作站软件；电子分析天平:感量0.00001 g；KQ3200型超声波清洗器；CAMAG REPROSTAR 3成像系统；双槽展开缸；硅胶 G薄层板（10 cm×20 cm），批号:20090803，购自烟台市化学工业研究所；乙腈，色谱纯，购自默克公司；甲醇、盐酸等试剂均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司；水由实验室MILLIPORE超纯水仪自制。

1.2 试药 盐酸小檗碱对照品（批号Z0221507），购自中国兽医药品监察所；盐酸巴马汀对照品（批号110732－201812），购自中国食品药品检定研究院；黄连对照药材（批号120913－201611），购自中国食品药品检定研究院。白头翁口服液分别购自北京、山东等地。

2 薄层色谱法优化研究

2.1 溶液的制备 供试品溶液:取本品1.5 mL，加甲醇10 mL，摇匀，作为供试品溶液。对照药材溶液:取黄连对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，置水浴上加热回流15 min，滤过，滤液作为对照药材溶液①；取黄连对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，超声提取15 min，滤过，滤液作为对照药材溶液②。对照品溶液:取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2 试验方法 照薄层色谱法（《中国兽药典》2015年版二部附录0502）[3]试验，吸取上述三种溶液各2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，分别以苯－乙酸乙酯－甲醇 － 异丙醇 － 浓氨试液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）（图1）、环己烷－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）（图 2）、环己烷 － 乙酸乙酯 －异丙醇 －甲醇 －水 － 三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）（图3）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.3 结果判断 供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。三张色谱图中（图1～图3），供试品在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点。

2.4 结果分析 黄连对照药材采用回流提取法和超声提取法所得到的薄层色谱图完全一致，为简便试验操作，可将回流提取优化为超声提取。三张色谱图比较（图1～图3），展开剂环己烷－乙酸乙酯－异丙醇 －甲醇 － 水 － 三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）（图3）斑点清晰，分离度较好，可替代原含苯的展开剂。方法对比见表1。

图1 白头翁口服液薄层色谱图Fig 1 The layer chromatography of Baitouweng Oral Solution

图2 白头翁口服液薄层色谱图Fig 2 The layer chromatography of Baitouweng Oral Solution

图3 白头翁口服液薄层色谱图Fig 3 The layer chromatography of Baitouweng Oral Solution

表1 两种薄层色谱法对比列表Tab 1 Comparison of these two thin layer chromatography

3 含量测定方法的建立及方法学考察

3.1 色谱条件 色谱柱 Agilent SB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相:乙腈－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节 pH为4.0），检测波长:347 nm，流速:1.0 mL/min，进样量:10 μL。

3.2 对照品溶液的制备 取盐酸巴马汀对照品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸巴马汀对照品储备溶液；取盐酸小檗碱对照品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸小檗碱对照品储备溶液。精密量取盐酸巴马汀对照品储备溶液10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为盐酸巴马汀对照品溶液；精密量取盐酸小檗碱对照品储备溶液10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为盐酸小檗碱对照品溶液。精密量取盐酸巴马汀对照品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液各25 mL，置100 mL量瓶中，作为混合对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

3.3.1 提取溶剂考察 精密量取供试品溶液2 mL置50 mL量瓶中，分别加入甲醇、甲醇 －盐酸（100∶1）的混合溶液适量，超声 10 min，放置至室温，分别加入甲醇、甲醇－盐酸（100∶1）的混合溶液稀释至刻度。以甲醇为提取溶剂的供试品与以甲醇－盐酸（100∶1）的混合溶液为提取溶剂的供试品相比，盐酸巴马汀的峰面积为其88%，盐酸小檗碱的峰面积为其85%。故选择甲醇－盐酸（100∶1）的混合溶液为供试品溶液的提取溶剂。

3.3.2 提取时间考察 精密量取供试品溶液2 mL置50 mL量瓶中，加入甲醇－盐酸（100∶1）的混合溶液适量，分别不超声直接稀释至刻度、超声10 min放置至室温后稀释至刻度、超声20 min放置至室温后稀释至刻度、超声30 min放置至室温后稀释至刻度，进样，测得的盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD值均小于1.8%，说明不超声、超声10 min、超声20 min、超声30 min提取效率相同。为确保供试品溶液混合均匀，兼顾检验效率，最终选择超声10 min作为供试品提取方式。

3.3.3 供试品溶液制备方法建立 精密量取供试品2 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇 －盐酸（100∶1）的混合溶液适量，超声10 min，放置至室温，加甲醇－盐酸（100∶1）的混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

3.3.4 自制供试品溶液的制备 实验室照白头翁口服液制法自制，即取白头翁30 g、黄连15 g、秦皮30 g、黄柏22.5 g，每次加水100 mL煎煮，煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液加入乙醇，使含醇量达到75%，静置12 h，滤取上清液回收乙醇，加水调至97.5 mL，即得。

3.3.5 阴性供试品溶液的制备 处方中不加黄连、黄柏，其他同白头翁口服液制法，即取白头翁30 g、秦皮30 g，每次加水100 mL煎煮，煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液加入乙醇，使含醇量达到75%，静置12 h，滤取上清液回收乙醇，加水调至97.5 mL，作为阴性供试品溶液。

3.4 含量测定方法学验证试验

3.4.1 检测波长的选择 照“3.1”项下色谱条件，分别进样混合对照品溶液和供试品溶液，所得紫外吸收光谱图见图4。综合《中国兽药典》2015年版二部中黄连含量测定项下345 nm的检测波长，选择347 nm作为白头翁口服液含量测定的测定波长。

3.4.2 纯度检查 照“3.3.3”项下方法制备供试品溶液，照“3.1”项下色谱条件，进样检测。测得盐酸巴马汀峰的纯度角度为0.196，纯度阈值为0.276，纯度角度＜纯度阈值；测得盐酸小檗碱峰的纯度角度为0.105，纯度阈值为0.241，纯度角度＜纯度阈值。纯度检查符合要求。

3.4.3 专属性试验 分别吸取阴性供试品溶液、盐酸巴马汀对照品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、自制供试品溶液各10μL，照“3.1”项下色谱条件测定，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱与相应的对照品色谱峰保留时间一致，达到基线分离。阴性供试品溶液色谱中与盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰相应的保留时间处无吸收峰，表明制剂中其他成分对测定无干扰，见图5。

图4 紫外吸收光谱图Fig 4 The ultraviolet absorption spectrum

图5 高效液相色谱图Fig 5 The high performance liquid chromatogram

3.4.4 线性关系考察 精密量取盐酸巴马汀对照品储备溶液、盐酸小檗碱对照品储备溶液及盐酸巴马汀对照品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液适量，置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.16、0.5、5、10、20、40、80 μg/mL 的混合对照品溶液，滤过，分别进样10μL，测定。以对照品溶液浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线，得盐酸巴马汀、盐酸小檗碱回归方程（n＝7）:Y＝ 75500.38X＋4888.63，r＝1.00；Y＝68437.27X＋2263.89，r＝1.00。 结果表明，盐酸巴马汀在0.16～80μg/mL、盐酸小檗碱在0.16～80μg/mL范围内，峰面积与溶液浓度线性关系良好，见图6、图7。

图6 盐酸巴马汀线性关系图Fig 6 Linear relationship diagram of Palmatine hydrochloride

图7 盐酸小檗碱线性关系图Fig 7 Linear relationship diagram of Berberine hydrochloride

3.4.5 重复性试验 取自制供试品，照“3.3.3”项下方法配制6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算含量。结果盐酸巴马汀、盐酸小檗碱平均含量分别为 167.22、315.43μg/mL，RSD分别为0.47%、0.58%，表明方法重复性良好。

3.4.6 精密度试验 取“3.2”项下的混合对照品溶液，照“3.1”项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积并计算RSD值。盐酸巴马汀、盐酸特比萘芬的RSD分别为0.16%、0.15%，表明方法精密度良好。

3.4.7 稳定性试验 取“3.2”项下的混合对照品溶液，分别在0、6、12、24 h 各进样 10 μL，测定盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的峰面积，其RSD分别为1.65%、1.74%，表明供试品溶液稳定性良好。

3.4.8 定量限与检出限 精密吸取“3.2”项下混合对照品溶液逐步稀释，取稀释后溶液进样检测。按照10倍噪音计算最低定量限浓度，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的最低定量限浓度均为0.16μg/mL；按照3倍噪音计算最低检出限浓度，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的最低检出限浓度均为0.12μg/mL。

3.4.9 回收率试验 白头翁口服液中盐酸巴马汀的量为 167.22μg/mL，盐酸小檗碱的量为315.43μg/mL。分别按照三个添加量添加对照品，盐酸巴马汀添加量为272.40、325.92、397.44μg，盐酸小檗碱添加量为503.50、634.80、759.00μg，每个添加量平行三份，照“3.3.3”项下制备供试品溶液，照“3.1”项下色谱条件测定，计算加标回收率（表2）。其中，盐酸巴马汀的回收率在99.22% ～102.27%之间，平均回收率为100.93%，RSD值为0.96%；盐酸小檗碱的回收率在99.86% ～102.97之间，平均回收率为101.45%，RSD值为1.07%。上述试验结果表明该方法回收率高。

表2 加标回收率试验数据表Tab 2 Sample recovery rate test results

3.4.10 耐用性试验

3.4.10.1 色谱柱类型考察 取白头翁口服液供试品溶液，考察Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、资生堂MGⅡC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、资生堂MGⅡC18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）对两种成分保留时间、分离度、拖尾因子、理论塔板数的影响。结果见表3。根据色谱柱类型考察结果可以看出，在四种类型的色谱柱上，两成分峰的理论板数均大于9000。参考《中国兽药典》2015年版二部黄连含量测定方法，规定本含量测定方法理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。

表3 色谱柱类型考察Tab 3 Investigation of Column type

3.4.10.2 流动相比例、pH值、色谱柱温度考察取白头翁口服液供试品溶液，改变流动相【乙腈－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH为4.0）】的比例分别为52∶48；50∶50；48∶52 进行测定；改变流动相pH值分别为3.8、4.0、4.2进行测定；改变色谱柱柱温分别为25℃、30℃、35℃进行测定，盐酸巴马汀峰与盐酸小檗碱峰的分离度、拖尾因子、理论塔板数均符合要求，上述试验结果表明该方法耐用性良好。试验结果见表4～表6。

表4 流动相比例考察Tab 4 Investigation of flow phase proportion

表5 流动相pH考察Tab 5 Investigation of pH of flow phase proportion

表6 色谱柱温度考察Tab 6 Investigation of Column temperature

4 讨论与结论

4.1 含量限度的确定 参照《中国兽药典》2015年版二部黄连、黄柏含量测定方法分别对黄连、黄柏中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量进行测定。黄连药材中盐酸巴马汀含量为33.08 mg/g，黄连药材中盐酸小檗碱含量为126.40 mg/g；黄柏药材中盐酸小檗碱含量为103.04 mg/g。自制白头翁口服液中，盐酸巴马汀含量为4.68 mg/g，盐酸小檗碱含量为4.58 mg/g。计算可得盐酸巴马汀转移率为14.15%，盐酸小檗碱转移率为4.07%。

照《中国兽药典》2015年版二部中黄连、黄柏中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱最低含量，结合转移率，计算得到白头翁口服液中盐酸巴马汀含量应不低于0.33 mg/mL，盐酸小檗碱含量应不低于0.63 mg/mL。考虑到药厂大规模生产转移率低于实验室小试转移率，结合市售样品情况，将含量限度降低20%，含量限度拟定为:白头翁口服液每1 mL含黄连、黄柏以盐酸小檗碱（C20H18ClNO4）计，不得少于0.50 mg；每1 mL含黄连以盐酸巴马汀（C21H22ClNO4）计，不得少于0.26 mg。

4.2 市售白头翁口服液样品质量评价 取按原标准检验合格的7个厂家，共9批白头翁口服液，照优化后的薄层色谱法及新建立的高效液相色谱法进行检验。薄层色谱法结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点，结果与原标准一致。高效液相色谱法结果表明，仅有3批白头翁口服液中盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量符合要求，合格率为33%。这表明，部分生产企业在生产白头翁口服液过程中存在少投黄连或使用劣质黄连进行药物生产的现象，白头翁口服液质量标准的提高可对此类现象进行有效打击。