大肠杆菌生物膜形成特性及控制措施的研究进展

吴丽娜，董鹏程，张一敏，毛衍伟，梁荣蓉，朱立贤,*，罗 欣,2

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

大肠杆菌（Escherichia coli）根据致病性通常分为两大类：肠内大肠杆菌和肠外大肠杆菌。肠内大肠杆菌基于其引起的疾病、毒力因子等可分为8 个亚组。这8 种致病型大肠杆菌分别是：与克罗恩氏病相关的黏附侵袭性大肠杆菌、弥散附着性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、肠毒素性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠毒性大肠杆菌、肠侵入性大肠杆菌（包括志贺菌属）和产生志贺毒素的肠聚集性大肠杆菌[1-2]。肠毒性大肠杆菌具有多种血清型，大肠杆菌O157:H7是其中最典型的一种血清型，其感染剂量低、致病力强、危险性大、临床症状严重，其污染和危害已成为全球性广泛关注的公共卫生问题。大肠杆菌O157:H7可引起人感染性腹泻、出血性结肠炎（hemorrhagic colitis，HC）和溶血性尿毒综合征（haemolytic-uraemic syndrome，HUS）等疾病，严重时可致人死亡[3-4]。食品可以作为大肠杆菌O157:H7污染的源头，例如牛肉、乳品等都可以作为大肠杆菌O157:H7的载体[3]。在过去的30多年中，我国从牛肉及其相关产品中分离出的160多种血清型大肠杆菌中，有79 种引发过人类疾病；从牛的粪便中分离出373 种血清型，有127 种引发过人类疾病[4]。Sharapov等发现在感染大肠杆菌O157:H7的176 例患者中，161 例（91%）是由于食用被污染的菠菜从而引起疾病感染[5]。Atnafie等对150 头健康的待宰牛共630 个样本进行了大肠杆菌O157:H7鉴定，发现有15 个样品呈阳性，总体检出率为2.4%[6]。其他血清型的大肠杆菌也曾引起严重疫情爆发，2011年德国爆发的大肠杆菌O104感染，波及16 个国家，近4 000 人感染，其中54 例死亡，22%的患者发生溶血性尿毒综合征[7]。Paquette等对加拿大西部牛粪中大肠杆菌O178的流行率进行了调查，普通聚合酶链式反应结果显示1 773 个样品中有873 个检测出大肠杆菌O178[8]。

生物膜是指微生物为了适应环境，黏附于非生物或活性组织表面，分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等不均一的胞外基质，将菌体自身包裹在其中而形成的大量菌体聚集膜状物，是菌体在自然界中一种常见的生存状态，直接影响着人类生产和生活的各个方面[9]。食品腐败菌以及食源性致病菌常常通过形成生物膜附着在食品、食品加工设备、包装材料等表面，难以杀灭与清除，从而形成持续性的污染，产生食品安全隐患，造成巨大的经济损失[10-11]。大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌，均可在食品或食品器具表面形成生物膜[12-13]。

大肠杆菌的生物膜形成经历可逆黏附、不可逆黏附、成熟、分散4 个阶段，在不同时期，其组成比例、结构形态、耐药性和清理难易程度都不同。在形成生物膜的过程中，首先菌体可逆地附着于表面，相互聚集，随着菌体继续生长繁殖，细菌与表面产生强烈的相互作用，发生不可逆的附着，细菌从浮游状态转变为固定状态，然后细菌继续繁殖并产生胞外基质，胞外基质被大量分泌。最后，细菌从成熟状态变为分散状态，寻找新的表面定植。大肠杆菌O157:H7可以通过形成生物膜的复杂细胞群落而定植在生物和非生物表面，并对细菌形成一层保护层，这种现象对于食品工业来说应引起重视，因为原材料的洗涤处理及设备卫生的清洁和消毒程序可能对此无效。在食品加工工厂中，牛肉胴体污染通常发生在不同的加工阶段，这与加工时设备表面形成的生物膜有关[14]。生物膜增强细菌对外界不良环境抗性的能力，更增加了大肠杆菌O157:H7在食品加工过程中的交叉污染。根据美国国立卫生研究院统计，大约有65%的微生物感染和80%的慢性感染与生物膜有关[15]。因此，研究生物膜形成和发展的分子机制以及寻找有效的生物膜控制和清除策略是目前研究的重点。本文在前期学者研究的基础上，综述了大肠杆菌生物膜的形成机制及影响因素，并提出了一些消减措施，以期对大肠杆菌生物膜的控制提供一定帮助。

1 大肠杆菌生物膜形成的分子机制

大肠杆菌生物膜形成的遗传机制是一个复杂的过程，涉及到许多相关的途径以及基因，需要复杂和协调一致的调控，以在空间和时间上实现高效率。

1.1 基于细菌黏附的形成机制

细菌具有多种黏附机制，这是生物膜形成的初始步骤，大肠杆菌通过特异性毒力因子如卷曲菌毛、鞭毛、I型菌毛、黏附素等附着于非生物和生物表面是开始附着和生物膜形成的关键步骤。

鞭毛的驱动力与生物膜形成有关，是生物膜初始形成阶段所必需的，它可以使细菌运动，并具有克服生物或非生物表面和细胞之间可能存在静电斥力的能力。CsrA控制着多种生理过程，如碳代谢、生物膜形成、运动、群体感应（quorum sensing，QS）、上皮细胞侵袭和毒力因子的产生[16]。Wang Shaomeng等通过RNA-seq分析显示，与大肠杆菌O157:H7野生型菌株相比，参与鞭毛生物合成的53 个基因在csrA::kan突变体中的检出率显著降低，这些差异调节的基因包括合成鞭毛所需的基因以及鞭毛基因表达的转录调节因子。在对大肠杆菌O157:H7野生型菌株、csrA::kan突变体、csrA补充菌株和csrA过表达菌株在半固体LB琼脂上的运动性研究中发现突变体不能产生生长晕，而csrA的过表达导致细菌运动增强，证明csrA可以调控大肠杆菌O157:H7的鞭毛生物合成和运动[17]。

卷曲菌毛是一种不同长度的薄而盘绕的纤维，它们在细胞外聚集形成无定形基质，参与定植和生物膜的发育，有助于大肠杆菌O157:H7在不锈钢表面的附着[18]，在附着过程中，基于转录分析，调控卷曲菌毛产生的基因被上调，从而为不利环境中生存的菌株提供保护[19]。卷曲菌毛是高度黏附的功能性淀粉类似物，由不同转录的csgBAC和csgDEFG操纵子编码，通过促进最初的细菌-基质相互作用和随后的细胞-细胞聚集而在生物膜形成中起重要作用[20]。CsgD可以促进大肠杆菌从浮游生物转化为生物膜的存在形式[21]。在生物膜状态，调节生物膜形成的CsgD（卷曲菌毛基因的正调节子）、BssR（生物膜形成调节蛋白）、FlhDC（转录激活因子）表达上调，QseB（转录调节因子）、YkgK（动力负调节器）、Bdm（生物膜依赖性调节蛋白）表达下调[22]。其中，FlhDC和CsgD调控驱动力和卷曲菌毛的产生，Hha调控FlhDC和CsgD，FlhDC和CsgD调控生物膜卷曲菌毛基因的表达，影响在大肠杆菌O157:H7中生物膜的形成，与野生型菌株相比，hha突变体在30 ℃和37 ℃下形成大量的生物膜[23]。Carter等发现卷曲菌毛使大肠杆菌O157:H7在菠菜叶和不锈钢表面的初始附着量显著增加5 倍，而在LB无盐肉汤中玻璃上的生物膜生成量增加了19～27 倍[18]。

I型菌毛也在大肠杆菌的黏附中起着重要作用，fim基因编码的I型菌毛可以促进细菌在表面的黏附，还可以通过增强细胞与表面的相互作用提供对非生物表面的黏附力，促进细胞与细胞的通讯[24]。

但是关于黏附素分泌信号的性质或不同类型黏附素之间的相互作用，支持或调节黏附素与表面之间相互作用的确切分子机制仍然尚不明确，加强对黏附素黏附特性的理解对控制细菌表面附着十分重要。

1.2 基于胞外多糖的形成机制

细菌在表面黏附后会分泌胞外多糖，可作为调节薄膜及在非生物表面（不锈钢等）上的黏合剂，从而影响细胞附着和形成生物膜结构[25]。大肠杆菌生物膜含有3 种主要的胞外多糖：β-1,6-N-乙酰-D-葡糖胺聚合物（β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine polymer，PGA）、纤维素和荚膜异多糖酸[24]。

PGA通过介导细胞间黏附和附着到生物或非生物表面帮助生物膜形成，可以作为稳定大肠杆菌生物膜的黏附素。大肠杆菌pgaABCD操纵子编码包括参与PGA聚合物的合成、运输和定位的PgaC糖基转移酶的蛋白质[22]。Kang Jiamu等发现可以通过抑制pgaABCD基因来抑制大肠杆菌生物膜的形成[26]。

纤维素的合成是生物膜形成的原因之一。Uhlich等发现纤维素产生与生物膜形成相关，然而，纤维素产生是可变的，并且取决于细菌菌株和环境条件[27]。Park等发现产生相对较低量纤维素的菌株在其接触表面上产生较少的生物膜[28]。

荚膜异多糖酸在细菌周围形成荚膜并保护它们免受特定的环境条件影响，它的产生可以保护大肠杆菌O157:H7免于渗透和氧化应激，这表明荚膜异多糖酸可能与大肠杆菌O157:H7生物膜形成有关[29]。Lord等的研究表明MqsR控制的荚膜异多糖酸和生物膜调节剂（McbR，也称为YncC）是早期大肠杆菌生物膜发育中高度诱导基因的蛋白质产物，并被认为是阻断生物膜形成的靶标[30]。mcbR的缺失导致荚膜异多糖酸过量产生，因此导致生物膜形成量的减少[31]。Vogeleer等也发现，荚膜异多糖酸可以通过掩盖抗原43和AidA，显示出对生物膜形成的抑制作用[14]。

1.3 基于QS系统的形成机制

细菌通常通过被称为QS的细胞-细胞信号传导机制相互沟通，QS是生物膜发育过程中的主要行为者[32]。这种细菌细胞间信号传导涉及称为自诱导物（autoinducer substances，AI）的细胞外信号分子的产生、检测和响应。细菌分泌AI到细胞外环境，当达到所需的浓度时，促进生物膜形成。QS是细菌用来沟通和协调其行为和功能的过程，像多细胞生物一样，它也控制生物膜形成和成熟过程中的基因表达。一旦AI达到一定浓度，就会与调节毒力因子基因表达的调节蛋白相互作用，并增加运动性、菌毛和热不稳定毒素的表达[33]。

在革兰氏阴性菌中，AI-1（N-酰基高丝氨酸内酯）和AI-2（呋喃糖基硼酸二酯）两种AI都存在。AI-1调节系统由两个结构基因组成：luxI编码AI-1合酶和luxR编码AI-1应答调节子。LuxI和LuxR同系物存在于各种革兰氏阴性菌中，并控制从毒力到生物膜形成的许多过程[24]。大肠杆菌中不能合成N-酰基高丝氨酸内酯，但其基因组可以编码SdiA，SdiA是AI-1传感器，可以编码LuxR的同源蛋白，大肠杆菌可以通过编码SdiA上调uvrY和csrA基因，增强大肠杆菌的生物膜形成、运动性和毒力[34]。

AI-2的合成途径涉及两个酶促步骤：5'-甲基硫代腺苷核酸酶或S-腺苷高半胱氨酸核酸酶催化S-腺苷高半胱氨酸转化为S-核糖高半胱氨酸和腺嘌呤；然后AI-2合成酶（LuxS）将S-核糖高半胱氨酸转化为高半胱氨酸和4,5-二羟基-2,3-戊二酮[35]。Jani等发现缺乏AI-2结合蛋白LsrB和化学感受器Tsr的大肠杆菌更不容易自聚集和形成表面黏附结构[36]。此外，AI-2对肠出血性大肠杆菌的趋化性吸引受两种受体的调节：用于运动的表型功能、介导细胞基质附着和生物膜形成的LsrB和LsrR[37]，LsrR可以通过直接结合lsr启动子区域内的两个LsrR结合框来抑制操纵子和其自身的转录[38]。AI-2在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中的信号传导特性增加了对不同环境条件的适应性、黏附能力以及生物膜形成量。由于AI-2在细菌中广泛存在，因此从这一途径入手成为研究生物膜的热点之一。

此外，也有学者研究发现qseBC编码的QS系统调节大肠杆菌O157:H7对细菌AI-3、哺乳动物应激激素肾上腺素和去甲肾上腺素应答的运动性。qseC编码感应激酶响应于AI-3、哺乳动物应激激素肾上腺素或去甲肾上腺素而自磷酸化，随后使其同源响应调节剂QseB磷酸化。在没有QseC的情况下，QseB会下调动物模型中的细菌动力和毒力[39]。而且，与野生型培养相比，qseC缺失菌株的运动性和生物膜形成量降低了一半[40]。

2 影响大肠杆菌生物膜形成的因素

生物膜的形成受到许多因素的影响，比如菌株特性、黏附材料特性以及pH值、温度、营养条件和其他条件等，尤其是在食品加工中，所处环境更是复杂多样。

2.1 菌体特性

有研究显示菌株特性如自聚性、泳动性、疏水性会显著影响细菌的成膜能力，而且生物膜形成能力是高度依赖于菌株的，并且与细胞外聚合物结构的细胞表面表达有关[41]。此外，血清型也能够影响菌株的黏附性能，例如，Wang Rong等对大肠杆菌O157:H7与Non-O157在玻璃表面气-液界面上成膜效力的研究发现，Non-O157表现出更高的成膜效力[42]。但是也有学者研究发现生物膜形成在产志贺毒素大肠杆菌菌株之间具有很大的变异性，并且不能与特定的脉冲型相关，甚至不与血清型或毒力基因存在相关性[43]。

2.2 生存环境

菌体的生存环境对生物膜有很大的影响，生存环境中的营养条件、pH值、离子种类与含量以及温度和时间等因素都影响着生物膜的形成。在食品加工过程中，不同工序所处的温度不同，对大肠杆菌O157:H7生物膜形成有影响，有学者发现大肠杆菌在30 ℃和37 ℃时生物膜形成能力比在25 ℃高，在较高的温度下会促进生物膜的形成[27]。不仅温度影响生物膜的形成，菌株所处环境的营养条件不同，形成的生物膜数量也不一致。Beauchamp等研究发现大肠杆菌O157:H7在胰蛋白胨大豆肉汤、牛肉脂肪/瘦肉组织匀浆、输送带冲洗液、碎牛肉、牛肉脂肪等生长基质中的黏附量不同，牛肉脂肪上黏附量最大，其次是碎牛肉、牛肉脂肪/瘦肉组织匀浆、胰蛋白胨大豆肉汤、输送带冲洗液，这可能是由于基质中营养物质的组成与含量的差别所致[13]。另外，附着基因（adrA、bapA、csgB、csgD和csrA）的相对表达水平也受到生长培养基类型的影响，这也表明生物膜形成的机制与细胞的生长环境有关[44]。大多数关于生存环境对生物膜形成的研究是在实验室中以标准培养基（如胰蛋白胨大豆肉汤、LB培养基等）为生长基质，并不能很好地模拟工厂实际生产条件，关于这方面的研究还有待加强。

2.3 接触面

食品加工接触面的材质也是影响细菌黏附的关键因素，不同的表面特性会显著影响菌体的黏附效果。Carter等发现大肠杆菌O157:H7菌株在不锈钢、玻璃、塑料上生物膜形成能力并不相同[18]。聚合物表面的疏水性显著影响生物膜形成的动力学和结构，在聚偏二氟乙烯的疏水表面上快速形成均匀、平坦和薄的生物膜，亲水性表面的聚乙烯醇防止细菌黏附和生物膜形成；然而，在200 h的长期孵育中形成局部粗糙和厚的生物膜，中等疏水性的聚醚砜在68 h时观察到粗糙和厚的生物膜，并且其厚度和覆盖度随着孵育时间延长而增加[45]。另有学者研究发现，在不同的接触面上，大肠杆菌O157:H7对氯化氢和二氧化氯两种杀菌剂的抗性不同，以木材＞塑料＞玻璃＞不锈钢的顺序增加[46]。这表明在不同的接触面生物膜形成能力不同，而且对消毒剂的抗性也不同，选择适当类型的食品接触表面，确定合适的消毒剂对抑制大肠杆菌的生长非常有效。

2.4 其他细菌的拮抗作用

关于单一细菌生物膜的研究已有较多，许多学者开始研究混合菌种的相互作用。食品加工环境中存在各种各样的细菌物种，它们可以在接触面上形成生物膜，但表面相关的群落通常是不同物种的复杂关联，有着不同的相互作用方式，这种相互作用在形成生物膜结构中起着关键作用，并对特定功能负责。Visvalingam等发现将大肠杆菌O157:H7与沙门氏菌或其他大肠杆菌共同培养时会产生拮抗作用，这可能部分归因于它们密切相关的营养需求，当营养物质有限时会导致竞争，产生有毒代谢物如大肠菌素等抑制性物质[47]。但是也有学者发现大肠杆菌O157:H7和石竹伯克霍尔德氏菌（Burkholderia caryophylli）、危险罗尔斯顿菌（Ralstonia insidiosa）这类生物膜形成能力强的细菌在生物膜形成中发生协同作用[48]。

3 大肠杆菌生物膜的控制措施

大肠杆菌生物膜可以在食品设备表面形成，降低消毒剂的有效性。而且因为生物膜的脱落，细菌会释放到食品或加工环境中，对设备上的生物膜进行彻底地去除特别困难。生物膜不仅可以保护工业设施中的细菌，增加对临床抗生素和杀菌剂的抵抗力，而且还可以帮助细菌抵抗人体的免疫清除效果。20多年来，国内外学者一直致力于研究有效的生物膜靶向治疗。但是，由于生物膜不是由同代微生物菌落形成的单层细胞结构，而是由在时间和空间上世代交替的菌落共殖，因此对于细菌具有强保护作用，需要采取有效的预防和消除生物膜措施。

3.1 化学杀菌

在屠宰场或食品加工厂，大多使用乳酸、过氧乙酸、季铵盐类消毒液、二氧化氯、乙醇等进行消毒杀菌处理，其可以对生物膜起到一定的抑制作用，但并不能使生物膜完全灭活，菌株消毒处理后在不同的水平上表现出恢复生长的迹象[49]，且长期使用可能会使细菌产生抗性[50]。Park等在分别用体积分数2%乙酸、乳酸和酸性消毒剂（活性成分是磷酸）、碱性消毒剂（活性成分是氢氧化钾、磷酸和次氯酸钾）对聚苯乙烯和不锈钢表面的生物膜处理后，菌株没有得到完全去除，这可能是由于生物膜和所用试剂之间的接触时间不足或试剂对生物膜表面区域的不适当覆盖造成的[28]。也有学者研究发现细菌生物膜的胞外结构可能会限制氯处理功效[51]。生物膜的刚性网络结构使得消毒剂难以进入关键的目标区域，并且生物膜基质可以中和氯等不稳定的消毒剂，从而减弱消毒剂的消毒效果[52]。另外Corcoran等发现生物膜对次氯酸钠、氢氧化钠和苯扎氯铵这些试剂的敏感性与生物膜的形成时间有关，因为随着生物膜成熟度的增加，试剂通过生物膜三维结构的扩散效率会降低[53]。因此，应该在早期进行适当地消毒，以防止生物膜成熟。

3.2 QS系统抑制剂

QS系统在生物膜形成过程中发挥重要作用，寻找能够阻断QS系统信号的物质有利于抑制生物膜的形成。目前有很多学者对关于从QS方向抑制生物膜形成进行了研究。吲哚可以通过QS调节转录因子SdiA降低大肠杆菌生物膜，sdiA突变可以使生物膜形成量增加50 倍[54]。从楝树种子制备的粗提取物可通过干扰由SdiA调节的QS途径来抑制大肠杆菌中的生物膜形成和群集运动，当培养基中添加30 mg/mL的乙醇提取物时，发现生物膜形成量和群集运动能力分别被抑制92.1%和48.52%[55]。据报道，泡菜乳酸杆菌NR28也可以抑制AI-2信号途径[56]。虽然这方面的研究有很多，但是大多数都是关于单一菌株的研究，而从实际加工环境来说，对混合菌株的研究还很少，对混合菌膜的QS系统还不是很明确。

3.3 植物提取物

植物提取物在防止生物膜形成和抑制现有的生物膜方面显示出巨大的潜力，其因生物膜出现抗生素抗性而被开发作为常规抗生素的替代品。作为生物活性分子和可持续来源的绿色植物已经被用于治疗许多疾病和研发通过靶向细菌QS系统、基因抑制和减少表面结构产生抑制生物膜的新药物[57]。0.01%（体积分数）的肉桂皮油、肉桂醛和丁香酚能够显著降低大肠杆菌O157:H7的生物膜形成，转录分析显示肉桂皮油下调肠毒性大肠杆菌中的卷曲菌毛基因和志贺毒素基因stx2[58]。银杏酸和银杏提取物可以通过下调卷曲菌毛和原噬菌体基因显示出对大肠杆菌O157:H7生物膜形成的显著抑制作用[59]。从具有抗病毒和抗微生物特性的植物中分离的生物活性化合物香豆素和香草酮，可以通过抑制卷曲菌毛和运动基因减少大肠杆菌O157:H7群集运动、菌毛产生和生物膜形成的能力[60]。精油是来自植物材料的芳香油性液体，在体外实验中发现精油可以抑制大肠杆菌和沙门氏菌菌株的生物膜形成，而且单一精油的效果优于混合精油[61]。在另一项研究中，Maisuria等对富含酚类物质的枫糖浆提取物进行了包括大肠杆菌在内的致病菌的抗菌膜活性的测试，转录组分析揭示富含酚类物质的枫糖浆提取物有效地抑制多种耐药基因和与运动、黏附和生物膜形成相关的基因表达[62]。

3.4 物理杀菌

除了以上措施之外，其他方法也可以减少生物膜的形成。例如，使用极低频电磁场、超声波去除细菌生物膜[63-64]。除此之外，等离子体对于大肠杆菌O157:H7生物膜也有较好的清除作用，有学者研究表明在作用功率500 W、连续作用4 min时，生物膜清除率达到99.99%；且激光共聚焦显微镜结果显示，在等离子体作用后，菌落数量和细菌生物膜厚度比对照组小，场发射扫描电子显微镜的观察结果也显示等离子组处理后细菌群落附着量显著减少[65]。

目前关于消毒剂对大肠杆菌生物膜控制及其机理方面的研究尚不深入，且长期使用可能会使细菌产生抗性，而一些植物精油或是其他天然提取物由于价格等方面的因素，目前还不能大规模的工业化应用，因此，亟待开发并深入研究能够应用于食品领域的新的控制生物膜的手段。

4 结 语

生物膜形成是细菌在不利环境条件下生存的重要手段，对食品、医疗、环境、机械等方面有着显著的影响，而且生物膜细菌对抗微生物剂具有高度的耐受性，难以根除。在食品加工过程中，生物膜一旦附着，很容易从上游产品污染下游产品，造成整个加工过程的污染，但在工厂中清除生物膜的相应手段还很少。大肠杆菌生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多种蛋白、核酸和多糖等因素，同时也受到各种调控网络的共同作用。目前对与大肠杆菌生物膜形成相关的多糖、生物膜成熟过程的调控机制等方面的研究相对缺乏。研究环境因素对大肠杆菌生物膜基质组成的影响，通过观察环境因素对生物膜中蛋白质、胞外多糖、胞外DNA组成的影响，进一步探究大肠杆菌生物膜的形成机制。对生物膜形成的营养多样性和生长条件的研究有助于设计有效的抗生物膜措施。同时，深入研究大肠杆菌生物膜形成和调控的分子机制对寻找特异性干预或检测靶点及评估其危害风险具有重要意义。