近江牡蛎糖胺聚糖的抗氧化活性及其稳定性

戴梓茹1,,禤日翔,孔 艳3,梁庆喜,梁冬萍,吴远清

(1.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室,广西钦州 535011; 2.北部湾大学食品工程学院,广西钦州 535011; 3.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004)

近江牡蛎俗称蚝、海蛎子,是一种高蛋白、低脂肪的食品。其营养价值高并含有大量的生物活性物质[1]。近江牡蛎被冠以“海洋牛奶”的美称,具有其独特的保健功能和药用价值[2-3]。牡蛎养殖业快速的发展,使得牡蛎产量迅速增加,导致牡蛎的市场价格下跌[4],因此,高效利用牡蛎资源具有一定的商业意义。

本文以近江牡蛎为原材料,经过酶解法获得近江牡蛎糖胺聚糖,采用清除·OH和DPPH·法研究近江牡蛎糖胺聚糖的·OH和DPPH·清除能力,并探讨近江牡蛎糖胺聚糖的抗氧化活性及稳定性,从而为保健食品和药品行业的开发利用提供相关的理论基础和参考依据,为充分利用近江牡蛎的生态资源提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

近江牡蛎(Conchaostrea) 采集于钦州茅尾海海域,样品采集后冰盒中冷藏,并迅速运回实验室,去壳,清洗干净后-20 ℃冻藏,备用;胰蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶 5000 U/g,国药集团化学试剂有限公司;胃蛋白酶(250000 U/g) 美国西格玛公司;磷酸盐缓冲溶液(pH7.4) 北京索莱宝科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 海金穗生物科技有限公司;95%乙醇 AR,成都市科隆化学品有限公司;邻二氮菲 AR,广东光华科技股份有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) AR,广东省化学试剂工程技术研究开发中心;硫酸亚铁(FeSO4) AR,天津市大茂化学试剂厂;过氧化氢(H2O2) AR,山东顾澎化工有限公司;硅藻土 AR,宁波鼎创新材料有限公司;活性炭 AR,河南瑞思环保科技有限公;浓硫酸 98%,西陇科学股份有限公司。

FD5-series冷冻干燥机 SIM公司;ZHSY-50WS恒温水浴振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;TGL20台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司;R-300EL旋转蒸发仪 瑞士步琪有限公司;V-1800PC分光光度计 上海美普达仪器有限公司;XS40精密分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 近江牡蛎糖胺聚糖制品的制备 参考胡雪琼等[19]的方法制备近江牡蛎糖胺聚糖:将新鲜的近江牡蛎去壳、清洗、沥干。将近江牡蛎全脏器与纯水按质量比1∶1搅拌混合,过胶体磨得到牡蛎浆液,调节pH至7.0,先加入1.0%的枯草杆菌中性蛋白酶混匀,放置在50 ℃恒温水浴振荡器酶解5 h后,90 ℃灭酶15 min。再调节pH至7.8,加入1.0%(质量分数)胰蛋白酶充分混匀后,在50 ℃下酶解5 h,最后经90 ℃灭酶15 min。将通过酶解后的近江牡蛎溶液制成3%水解液,加入1.0%(W/V)硅藻土与1.0%(W/V)活性炭混合物,65 ℃恒温水浴45 min,利用布氏漏斗进行抽滤,再离心取上清液。利用等电点除杂蛋白法精制,经0.45 μm有机滤膜抽滤后利用旋转蒸发仪进行浓缩处理,最后利用冷冻干燥得到近江牡蛎糖胺聚糖。

1.2.2 总糖和糖胺聚糖的测定 总糖的测定参考苯酚-硫酸法[20],准确称葡萄糖标准品20 mg溶解后定容至500 mL容量瓶中,分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 mL葡萄糖标准品溶液至带塞的试管中,各以蒸馏水补至2.0 mL,然后加入6% 苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀冷却,室温放置20 min以后于490 nm测光密度,以2.0 mL水按同样显色操作为空白,横坐标为葡萄糖标准品浓度,纵坐标为吸光度值,得标准曲线:y=3.0476x+0.0073(R2=0.9969)。将近江牡蛎糖胺聚糖稀释后,取2 mL按上述步骤操作测吸光度值,参照总糖标准曲线计算近江牡蛎糖胺聚糖的总糖含量。

糖胺聚糖含量的测定参照阿利新蓝比色法[3]绘制标准曲线。在比色管中分别加入0.2 mL的已经配置好的100、200、400、600 μg/mL的糖胺聚糖标准液(肝素钠),用0.1 mL水按同样显色操作为空白,在各管中精确加入1.5 mL的阿利新蓝染液,混匀。静置10 min后,于480 nm波长处测定吸光度值,以肝素钠浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制糖胺聚糖标准曲线为y=0.1332x+0.5134(R2=0.9965)。将样品液0.2 mL按上述步骤测定其吸光度值,通过标准曲线求出样品中糖胺聚糖的含量。

1.2.3 近江牡蛎糖胺聚糖体外抗氧化活性研究

1.2.3.1 ·OH清除率的测定 参考Li等[21]的方法测定羟基自由基(·OH)清除力(邻二氮菲法)。

分别称取近江牡蛎糖胺聚糖样品2.00 g,用水定容至100 mL,配制成20 mg/mL的化合物母液,继而以蒸馏水稀释制成2、4、6、8、10、12 mg/mL的一系列样品待测液。具体测定方法如下:

样品管:取0.6 mL邻二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH7.4)混匀后,加入0.6 mL样品溶液及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混匀后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),充分混匀后加入0.8 mL H2O2(0.1%),摇匀后于37 ℃保温1 h,536 nm处测吸光值计为As。

损伤管:以去离子水代替样品,其余步骤同样品管,所测吸光值计为Ad。

未损伤管:以去离子水代替H2O2,其余步骤同损伤管,所测吸光值计为Au。

样液对·OH清除率表示为:

1.2.3.2 DPPH·清除能力 DPPH法采用Bao等[22]的方法并稍作修改。分别称取近江牡蛎糖胺聚糖样品2.00 g,用水定容至100 mL,配制成20 mg/mL的化合物母液,继而以蒸馏水稀释制成2、4、6、8、10、12、14、16 mg/mL的一系列样品待测液。分别往试管中加入对应浓度样品待测液1 mL,加入1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L,溶于无水乙醇),振荡混匀,室温避光反应 30 min后,在517 nm处测其吸光值(AS),以1 mL无水乙醇加入1 mL蒸馏水调零,1 mL样品待测液与1 mL无水乙醇混合物于517 nm处所测吸光记为Ac,1 mL蒸馏水与1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合后再测定波长的吸光值记为A0。样液对DPPH·的清除能力表示为:

1.2.4 近江牡蛎糖胺聚糖稳定性研究 用蒸馏水配制浓度为6 mg/mL的近江牡蛎糖胺聚糖样品溶液100 mL,充分溶解后静置待用,抗氧化稳定性研究参照孟良玉等[23]的方法并稍作修改。

1.2.4.1 温度对糖胺聚糖稳定性的影响 各取样品液2 mL,分别在常温(25 ℃,对照)、40、60、80、100 ℃下处理1 h,取出放冰上冷却,用蒸馏水定容至5 mL,分别进行·OH和DPPH·清除率的测定。

1.2.4.2 pH对糖胺聚糖稳定性的影响 各取样品液4 mL,用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液将pH分别调整至2.0、3.5、4.0、6.0、8.0、10.0,不调节pH组为对照试验,用蒸馏水定容至5 mL,在室温静置1 h,分别进行·OH和DPPH·清除率的测定。

1.2.4.3 紫外照射对糖胺聚糖稳定性的影响 各取样品液4 mL,在紫外灯下分别照射时长为0(对照)、30、60、90、120、150 min,分别进行·OH和DPPH·清除率的测定。

1.2.4.4 NaCl浓度对糖胺聚糖稳定性的影响 各取样品液4 mL,分别加入2 mL浓度为1、2、3、4、5 mmol/L的NaCl溶液,同时加2.0 mL蒸馏水做对照,充分混匀放置15 min,分别进行·OH和DPPH·清除率的测定。

1.2.4.5 体外模拟胃肠道消化对糖胺聚糖稳定性的影响 用蒸馏水配制浓度为6 mg/mL的近江牡蛎糖胺聚糖样品溶液25 mL,取4 mL样品定容至5 mL,记做未处理液A。取8 mL样液用1 mol/L HCl调节pH至2.00,加入胃蛋白酶1.00 mg(20.00 mg/g),37 ℃恒温水浴90 min。用1 mol/L NaOH调节pH至7.50,定容至10 mL,收集一半反应液,记为消化液B,冷却至室温,备用。向另一半反应液中加入胰蛋白酶1.00 mg(40.00 mg/g),37 ℃恒温水浴120 min,90 ℃水浴15 min灭酶活,定容至5 mL,记为消化液C,冷却至室温。分别以未处理液A、消化液B和消化液C为待测液,进行·OH和DPPH·清除率的测定。

1.3 数据统计

2 结果与分析

2.1 近江牡蛎糖总糖和糖胺聚糖含量

依据1.2.2中总糖(以葡萄糖为标准品)、糖胺聚糖(以肝素钠为标准品)的各标准曲线公式,计算得出近江牡蛎糖胺聚糖的总糖含量为55.99%,糖胺聚糖含量为49.05%。

2.2 近江牡蛎糖胺聚糖体外抗氧化性研究

近江牡蛎糖胺聚糖DPPH·和·OH的清除率如图1所示。糖胺聚糖对DPPH·清除率有非常强的清除作用,其清除能力与质量浓度成正比,在样品浓度为2.00～12.00 mg/mL时随着浓度的升高,DPPH·清除率逐渐升高,但当样品浓度高于14.00 mg/mL时,随浓度的增加,清除率趋于稳定,此时近江牡蛎糖胺聚糖对DPPH·的清除率为79.15%。随着样品浓度增加,·OH清除率逐渐增强。当样品浓度为12 mg/mL时,·OH清除率达到了100.00%。结果表明近江牡蛎糖胺聚糖具有较好的体外抗氧化活性。综合分析近江牡蛎糖胺聚糖对·OH清除能力和DPPH·清除能力,最终选取近江牡蛎糖胺聚糖浓度为6 mg/mL进行近江牡蛎糖胺聚糖抗氧化活性的稳定性研究分析。

图1 近江牡蛎糖胺聚糖对自由基的清除效果Fig.1 Scavenging effect on free radicals of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.1 近江牡蛎糖胺聚糖稳定性研究分析 根据抗氧化活性·OH清除能力和DPPH·清除能力两个指标方法分析探讨近江牡蛎糖胺聚糖在不同温度、pH、紫外线照射时间、Na+浓度以及体外模拟肠胃道消化条件下的抗氧化能力的稳定性。

2.2.2 温度对糖胺聚糖稳定性的影响 由图2可知,温度对于近江牡蛎糖胺聚糖抗氧化能力有一定的影响(对照组为常温),随着温度升高,对·OH清除能力及DPPH·的清除能力均呈现出下降的趋势。在温度为40～80 ℃时,与对照组相比,DPPH·清除率显著下降(P<0.05),·OH清除能力有所下降,但其变化无显著性差异(P>0.05),但仍保持较高的抗氧化能力,温度为100 ℃时,·OH及DPPH·清除率显著下降(P<0.05),分别为23.63%和15.93%。左勇等[24]研究发现肝素钠的效价随温度升高而降低。牡蛎糖胺聚糖是一类肝素钠含量较高的多糖物质,抗氧化活性受温度影响较大。综合考虑,近江牡蛎糖胺聚糖在40～80 ℃时的抗氧化作用效果最好,可以依据此特点设定其抗氧化作用条件。

图2 温度对近江牡蛎糖胺聚糖稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis注:不同大写字母表示·OH清除率有显著性差异(P<0.05),不同小写字母表示DPPH·清除率 有显著性差异(P<0.05);图3～图6同。

2.2.3 pH对糖胺聚糖稳定性的影响 pH对近江牡蛎糖胺聚糖抗氧化活性影响如图3所示。随着pH的增大,近江牡蛎糖胺聚糖对·OH和DPPH·清除率显著降低(P<0.05)(对照组pH为2.21),在极酸环境(pH=2.00)下,·OH和DPPH·清除率分别为57.17%和54.00%,pH为4.00时，·OH和DPPH·清除率分别为33.65%和47.43%,pH为10.00时，·OH和DPPH·清除率下降为5.64%和4.42%,原因可能是糖胺聚糖也称酸性多糖,是阴离子多糖链呈酸性,在酸性条件下结构稳定,碱性条件下结构被破坏。从图3中可以看出,当pH在2～8时,随着pH的增大,牡蛎糖胺聚糖对DPPH·和·OH的清除率呈现的下降趋势具有显著性差异(P<0.05),当pH在8～10时,其下降趋势无显著性变化(P>0.05),对两种自由基都达到相对较低的清除率,其综合分析可以得出,近江牡蛎糖胺聚糖在碱性条件下抗氧化性质不稳定,在偏酸环境下抗氧化作用强,且稳定,因此在生产或保存近江牡蛎糖胺聚糖时,应控制在强酸环境下,以发挥其最强的抗氧化效果。

图3 pH对近江牡蛎糖胺聚糖稳定性的影响Fig.3 Effect of pH on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.4 紫外线照射对糖胺聚糖稳定性的影响 紫外线照射对近江牡蛎糖胺聚糖的抗氧化活性的影响如图4所示(对照照射时长为0 min)。随着紫外线照射时间的增加,近江牡蛎糖胺聚糖对DPPH·的清除能力缓慢减弱,照射时间在0～150 min时,对 DPPH·的清除无显著性变化(P>0.05),在照射时间为150 min时,清除率降到最低,为42.90%,此时,糖胺聚糖仍具有较强的抗氧化活性。随着紫外线照射时间的增加,糖胺聚糖对·OH的清除能力呈现出缓慢上升并在照射时间≥60 min时,对·OH的清除率无显著性变化(P>0.05),趋于稳定,清除能力最高达到76.84%。因此,紫外线照射条件下,糖胺聚糖能保持较好的抗氧化活性。

图4 紫外线照射时间对近江牡蛎糖胺聚糖稳定性的影响Fig.4 Effect of ultraviolet irradiation time on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.5 氯化钠对糖胺聚糖稳定性的影响 NaCl对近江牡蛎糖胺聚糖的抗氧化能力影响如图5所示(对照为蒸馏水)。添加浓度分别为1～5 mmol/L的NaCl溶液后,近江牡蛎糖胺聚糖对 DPPH·清除率显著下降(P>0.05),但仍保持较强抗氧化活性,且添加不同浓度NaCl对DPPH·清除率影响无显著差异。添加NaCl后,·OH清除率与对照组无显著差异(P>0.05)。说明了Na+的存在,近江牡蛎糖胺聚糖仍保持较好的抗氧化活性。

图5 氯化钠对近江牡蛎糖胺聚糖稳定性的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.6 体外模拟胃肠道消化对糖胺聚糖稳定性的影响 体外模拟胃肠道消化对糖胺聚糖抗氧化活性的影响如图6所示。在体外模拟胃肠道消化后,近江牡蛎糖胺聚糖抗氧化活性显著下降(P<0.05)。DPPH·清除能力在胃肠道消化后,消化液B与未处理液A无显著差异,肠道消化液C 的DPPH·清除率显著下降(P<0.05),但具有一定的清除能力(26.43%)。与未处理液A相比,在胃肠道消化后消化液B和消化液C的·OH清除能力显著下降(P<0.05),消化液B和消化液C无显著差异,仍具有一定的·OH清除能力,分别为12.06%、10.07%。近江牡蛎糖胺聚糖抗消化能力较弱,在加工过程中可经过稳定前处理以更好发挥其抗氧化活性。

图6 体外模拟胃肠道消化 对近江牡蛎糖胺聚糖稳定性的影响Fig.6 Effect of gastrointestinal digestion on stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis in vitro

3 结论

本研究以近江牡蛎全脏器为原料,通过酶解法得到近江牡蛎糖胺聚糖,通过测定·OH清除率和DPPH·清除率探讨其抗氧化能力及其稳定性。结果表明,近江牡蛎糖胺聚糖具有较好的体外抗氧化活性,并且在温度为40～80 ℃ 时,偏酸环境,紫外线照射以及含有Na+条件下,其抗氧化作用都能够都维持在一个较稳定的状态(DPPH·清除率>22.92%,·OH清除率>27.34%)。但是近江牡蛎糖胺聚糖抗消化能力较弱,在加工过程中可经过稳定前处理以更好发挥其抗氧化活性。近江牡蛎糖胺聚糖纯度不高或成分较为复杂等原因在一定程度上影响了其总体抗氧化能力。若能进一步通过超滤、色谱分析等方法进行分离纯化,可能会得到抗氧化活性更强的近江牡蛎糖胺聚糖。对近江牡蛎糖胺聚糖的体外抗氧化活性及稳定性的研究,为进一步研究开发和利用近江牡蛎提供了相关的理论基础和参考依据。