红茶菌微生物群落多样性及其分析方法的研究进展

(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京 100190)

近年来,随着人们膳食结构和饮食观念的改变,功能性食品的研究与开发成为当代食品领域的研究热点。红茶菌(又名康普茶,Kombucha、tea fungus)是一种通过多种微生物组成的“共生菌落(symbiotic associations)”发酵茶糖水而成的富含益生生物及活性成分的功能性饮料[1]。它在我国的饮用最早可追溯到公元前220年左右的秦朝,在当时被人们认为是能够解毒和赋予人能量的珍宝[2]。近年来随着现代检测技术及分子生物学技术的发展,红茶菌中有益微生物及其活性成分的研究日益深入。

红茶菌的“共生菌落”主要包括醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。这些微生物之间形成的强大共生关系及复杂代谢通路使得红茶菌中含有大量的活性成分,主要包括葡萄糖酸、醋酸、葡萄糖、果糖、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、茶多酚、咖啡因、乙醇和二氧化碳等[3-4]。而越来越多的研究表明红茶菌对多种疾病都具有潜在的治疗效果,包括抗氧化、抗致癌、抗糖尿病、提高免疫力、增强肝脏解毒能力,有助于胃溃疡和高胆固醇的治疗等[5-6]。正因红茶菌所具有的特殊功能,近年来红茶菌的市场呈指数增长,预计到2024年,全球红茶菌的市场预计将达到44.6亿美元[7]。

但我国红茶菌的生产仍停留在家庭自产自销的阶段,市场上鲜有相关成功产品。在粗放式的生产方式下,主要因操作不当发酵过程很容易发生污染和变质;因缺乏科学的培育和管理,菌种很容易发生变异、衰退和死亡;缺乏对红茶菌复杂微生物群落的认识和控制,难以保证产品的品质及稳定性[8]。因此深入研究红茶菌中的微生物群落的多样性及其功能,将有助于保证最终产品的品质、安全性及稳定性。近年来,红茶菌中微生物的研究从传统的依赖培养的单个微生物的分离、筛选、驯化,发展到依赖现代分子生物学技术的非培养依赖法的微生物群落分析。尤其是近些年来高通量筛选技术的快速发展,对以微生物发酵过程和机制的研究产生了深远的影响,包括微生物群落组成及动态变化、微生物生理功能及代谢能力、微生物对环境响应机制等方面。另外,通过基因组和元基因组对微生物群落进行数据分析,也为发酵过程优化、微生物功能改造、食源性微生物疾病预防和控制等提供了重要的依据。因此,本文通过对近年来红茶菌微生物多样性及其研究方法的分析与总结,以期为我国红茶菌产业化的快速发展提供理论基础和方法参考。

1 红茶菌中微生物菌群的相互作用

红茶菌发酵体系中主体菌群包括醋酸菌、酵母菌和乳酸菌,这些微生物之间存在着复杂的相互关系。其中酵母菌是“启动子”和桥梁(图1),在发酵的初级阶段(0～3 d)先将蔗糖等分解为葡萄糖和果糖,并进一步生成乙醇和CO2;葡萄糖醋杆菌利用葡萄糖和果糖为碳源开始快速生长繁殖,并生成乙酸、葡萄糖酸等代谢产物;乳酸菌利用酵母菌代谢产生的维生素和氨基酸等物质逐渐生长繁殖,并产生一定量的乳酸;当培养液中积累了一定量乙醇时,乳酸菌的发酵能力逐渐衰弱,酵母菌重新繁殖并占绝对优势;酵母菌生长阶段所产生的乙醇可以刺激葡萄糖醋杆菌产生更多的乙酸,乙酸又能刺激酵母菌产生乙醇[9]。乙酸、乙醇的存在可以保护葡萄糖醋杆菌和酵母菌免受其它菌株的侵染。另一方面,乳酸菌发酵水解生成的葡萄糖又可以供给酵母菌和葡萄糖醋杆菌进行生长繁殖[1]。张妍等[10]从红茶菌生物膜中分离得到葡糖杆菌属(Gluconobacterasai)和路德类酵母(Saccharomycodesludwigii),单独培养所分离出的醋酸菌产纤维素的速度和产量均远不及红茶菌混合菌群,而将这两种菌混合培养所得到的细菌纤维素的产量却大幅度提高。唐水佳等[11]发现以红茶菌和木葡糖酸醋杆菌作为生产菌株制备的细菌纤维素无本质区别,但是前者生产细菌纤维素的效率显著高于木葡糖酸醋杆菌,且产量是后者的3倍以上。这都说明红茶菌的混合菌群中存在着微生物之间的共生促进关系。总而言之,各菌群之间通过这种相互制约或促进的关系完成了红茶菌的发酵。

图1 红茶菌发酵体系中微生物菌群的相互作用关系Fig.1 Interaction of microflora in Kombucha fermentation system

2 红茶菌中微生物菌群的分析方法

目前关于红茶菌发酵体系中微生物的相关研究方法主要包括两大类,一类是培养依赖分析法(culturing-depending analysis),一类是借助分子生物学手段的非培养依赖分析法(culturing-independing analysis)。

2.1 培养依赖分析法

目前,对红茶菌中微生物深入研究的报道大部分还是基于培养依赖分析法完成的。采用培养依赖分析法,从红茶菌中分离得到了大量的细菌和酵母菌(如表1所示)。在细菌中最主要的是醋酸菌属(Acetobacter),另外还有葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)和乳酸菌(Lactobacillus)。其中醋杆菌主要包括木醋酸菌(A.xylinum)、液化醋杆菌(A.liquefaciens)、甲醇醋杆菌(A.methanolica)、醋化醋杆菌(A.aceti)、重氮营养醋杆菌(A.diazot-rophicus)、东方醋杆菌(A.orientalis)。葡糖杆菌属(Gluconobactersp.或Komagataeibactersp.)主要包括浅井式葡糖杆菌(G.asaii)、中间葡糖杆菌(G.intermedius)、木葡糖杆菌(G.xylinus)、中间葡糖杆菌(G.intermedius)、氧化葡糖杆菌(G.oxydans)、居间驹形氏杆菌(K.intermedius)和鼠李小松杆菌(K.rhaeticus)等[12-16]。乳酸菌主要包括内氏乳杆菌(Lactobacillusnagelii)、酒明串珠菌(Oenococcusoeni)等[12-13,17]。乳酸菌在培养依赖法中报道的较少,也曾一度被认为在红茶菌中是非特征菌。采用培养依赖法分离到的酵母菌主要有:类酵母属(Saccharomycessp.)的酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴氏酵母菌(S.pasteurianus)、路德氏酵母(S.ludwigii)等,裂殖酵母属(Schizosaccharomycessp.)的粟酒裂殖酵母(S.pombe)、假丝酵母属(Candidasp.)的布鲁克丝酵母属(C.crusei)、热带假丝酵母菌(C.tropicans)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)等,克勒克酵母属(Kloeckerasp.)、德克酵母属(Dekkerasp.)的布鲁塞尔德克酵母(D.bruxellensis)、德巴利酵母属(Debaryomycessp.)的汉逊德巴利酵母(D.hansenii)、接合酵母属(Zygosaccharomycessp.)的Z.kombuchaensis和拜耳接合酵母(Z.bailii)、酒香酵母属(Brettanomycessp.)的异酒香酵母(B.anomalus)等[12-13,18-21]。

表1 红茶菌共生体系中的微生物构成Table 1 Microbial composition in the symbiotic system of Kombucha

虽然传统培养法在微生物多样性方面没有优势,但在某些特定功能微生物的驯化和筛选方面具有不可替代的作用而被广泛应用。许多研究者基于培养依赖法对分离出的微生物进行了大量的研究。张妍等[10]利用从红茶菌中分离到的葡糖杆菌属(G.asaii)和路德氏酵母(S.ludwigii)混合进行细菌纤维素的生产,发现两者混合生产细菌纤维素的速度和产量都明显高于单独培养。Nguyen等[22]从红茶菌中筛选、分离得到既能产细菌纤维素又能产葡萄糖醛酸的醋酸菌(G.intermedius)和一株高耐酸的布鲁塞尔德克酵母(D.bruxellensis),以这两株菌在最优比例下共生培养来生产葡萄糖醛酸,其产量可达到175.8 mg·L-1。Pavels等[23]从红茶菌中分离到一株鼠李小松杆菌(K.rhaeticus),该菌产细菌纤维素的能力远高于两种用于纤维素生产的参考菌株K.xylinusDSM 46604和K.hanseniiDSM 5602T。林娟等[24]利用从红茶菌样品中分离得到的酿酒酵母(S.cerevisiae)、葡糖醋杆菌(Gluconacetobactersp.)复配植物乳杆菌实现了多菌种的纯菌混合发酵生产红茶菌,且发酵周期缩短了5倍。

2.2 非培养依赖分析法

培养依赖分析法使红茶菌中可培养微生物及其特性得以被认知并加以应用。已有报道称,经过大约10 d的发酵后,红茶菌的微生物群落中细菌和酵母的数量通常会达到104～106cfu·mL-1,并且酵母的数量略多于细菌,茶汤中的微生物数量大于纤维素膜[29-30]。但是研究人员发现,培养依赖分析法并不能充分描述整体微生物群落结构。因为某些微生物物种难以培养和分离,并且完全依赖于微生物的表型性状也会导致错误的识别。因而,以非培养为基础的分子生物学技术手段在红茶菌的研究中日益得到发展。目前在红茶菌中已被开发应用的主要包括高通量测序技术(High throughput sequencing,HTS)、末端限制性片段长度多态性分析技术(Terminal restriction fragment length polymorphism analysis,T-RFLP)、DNA宏条形码(DNA metabarcoding analysis)、寡核苷酸配型技术(Oligotyping)等。

2.2.1 高通量测序技术 高通量测序技术又被称为“下一代”测序(Next-generation sequencing)技术。它可以一次性对几十万到几百万条的 DNA分子进行序列的测定,使得对一个物种的转录组和基因组进行细致而全面的分析成为了可能[31]。高通量测序技术以环境样品中所有微生物的基因组为研究对象,分析环境样品中所有微生物的总和,包括可培养和未培养微生物。目前被广泛用于检测发酵食品中微生物群落的系统发育多样性,组成和动态结构变化,从而为描述和预测这些复杂物种之间的关系提供了机会[32-33]。

2014年Marsh等[34]第一次将高通量测序技术应用于红茶菌中微生物群落结构组成的研究,对来自于不同国家的五个红茶菌样本发酵菌液及菌膜中微生物群落进行了深入全面的解析。从红茶菌中鉴定了包括放线菌(Actinobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、嗜热双球菌(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌(Firmicutes)和变形杆菌(Proteobacteria)的5个细菌门。其中,变形杆菌最为丰富,在所测样本的菌液和生物膜分别均能占90%和60%左右,占主导地位的两个属是醋酸杆菌(Acetobacter)和葡萄糖酸杆菌(Gluconacetobacter),其中葡萄糖酸杆菌远远超过醋酸杆菌。而通过高通量测序发现,不同来源的红茶菌中均检测到了相当大比例的乳酸菌,包括乳酸杆菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus),其中主要的乳酸菌是开菲尔基质乳杆菌(L.kefiranofaciens)的一个亚种L.kefirgranum,并首次鉴定了明串珠菌(Leuconostoc)、支原体属(Allobaculum)、瘤胃球菌属(Ruminococcaceae)和肠球菌属(Enterococcus)中的一些种。并且发现这些乳酸杆菌在红茶菌发酵周期内是普遍存在的,特别是在发酵的后期阶段,这也改变了传统的认为红茶菌中乳酸菌非特征菌的观念。

从真菌的角度来看,非依赖培养分析法更加有益,因为酵母菌在培养基上的生长速度较细菌缓慢,这使得基于培养的酵母菌分离鉴定更为困难。红茶菌菌液中子囊菌(Ascomycota)是唯一的真菌门,其中接合酵母(Zygosaccharomycessp.)在所测样品中比例均大于95%,其次是毕赤酵母属(Pichiasp.),另外还有超过10%的未分类菌属。在多样性方面,红茶菌中酵母菌的多样性较高,且菌膜要高于菌液。因为在菌膜中还检测到了包括塔森球腔菌(Davidiellatassiana)、毛绒厌氧杆菌(Lachanceafermentati)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、芽殖酵母(Naumovozymacastelli)、耐盐真菌(Wallemiasebi)、草莓白冬孢酵母(Leucosporidiellafragaria)、发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichiaburtonii)等多种培养分析法中从未发现和报道的菌种。

宏基因组测序是利用新一代高通量测序技术,以特定环境下微生物群体基因组为研究对象,在分析微生物多样性、种群结构、进化关系的基础上,可进一步探究微生物群体功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系,对于微生物群落研究有着重要的意义[35-36]。另一方面,利用宏基因组技术还能够发现功能基因,研究群落的代谢通路(Meta-pathway),能够为微生物群落的代谢特征提供更加详细的解析。这也有利于将特定的代谢功能机制与环境背景联系起来,从而促进微生物生态的研究[37]。宏基因组技术也已经在红茶菌微生物群落多样性及其代谢途径的研究中得到利用。徐伟等[38]对传统红茶菌进行了宏基因组测序,将数据处理后得到的非冗余基因集蛋白序列与NR数据库进行blastp同源性比对,全面解析了红茶菌中的微生物群落组成。并进一步将非冗余基因集与KEGG数据库进行比对,发现了红茶菌中碳水化合物代谢通路中存在338类代谢途径,包括糖酵解、三羧酸循环、丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径、氨基酸代谢及丁酸酯代谢等代谢途径等,并检测到307个Unigene注释到次生代谢途径。进一步将这些途径与代谢产物及微生物群落联系起来研究其相互关系,发现这些代谢途径为许多物质的合成提供了原料,如芳香族氨基酸的合成,同时TCA循环和丙酮酸代谢途径产生大量的柠檬酸、乙酸、丁酸等有机酸使溶液的pH逐渐降低;氨基酸代谢途径与红茶菌液中14种氨基酸有关,其中有5种是人体必需氨基酸;维生素的代谢途径与多种维生素如B1、B2、B5和B12等有关;在次级代谢途径中发现甾醇、萜类等物质生物合成途径等。由此可见,基于高通量测序的宏基因学分析不仅可以快速准确地解析传统红茶菌菌群结构和各菌种的比例,同时阐明了红茶菌菌群的代谢机理,从而可以更有效地控制红茶菌的发酵进程。

2.2.2 末端限制性片段长度多态性分析技术 末端限制性片段长度多态性分析技术(T-RFLP)是以分子生物学技术为基础的较为先进的微生物群落研究方法。它是PCR技术、荧光标记技术、DNA限制性酶切技术和DNA序列自动分析技术的综合运用[39]。相对于其它分子生物学技术,T-RFLP具有很高的分辨率、容易实现自动化等特点,所以已经成为分析复杂环境微生物群落的强有力的工具之一。目前,该技术已被成功应用于菌种的鉴定、各种微生物群落的比较分析、微生物群落多样性及结构特征的研究等方面,是目前很有前景的微生物群落指纹图谱分析技术[40]。

但是T-RFLP技术也存在一些缺陷,比如无法区分近缘种微生物，只能看出各类微生物所占比例,无法定量及准确看出其变化趋势等。因此,为了更好地表征红茶菌中微生物群落的多样性特征,Chakravorty等[41]将高通量测序技术与T-RFLP结合研究红茶菌的发酵过程中微生物群落的动态变化规律。通过对酵母内部转录间隔区2(ITS2)和大亚组(LSU)核糖体RNA(rRNA)基因的D1-D2区域进行高通量测序以及细菌16S rRNA的V3区域进行T-RFLP分析。研究结果表明,在总体水平上,发酵菌液的生物多样性高于生物菌膜,酵母菌的多样性高于细菌。就酵母菌而言,在门水平,子囊菌占据了>98%的比例;在科水平上,酵母菌科(Saccharomycetaceae)占整个酵母菌群落的95%左右;在属的层面上,生物膜和发酵菌液中均以念珠菌属占主导;在种水平上,假丝酵母属亚种(Candidastellimalicola)是发酵菌液和生物菌膜中最主要的菌种。对细菌而言,总的来说,发酵菌液中的细菌群落比生物菌膜群落更加多样化。在门水平上,变形杆菌门(Proteobacteria)占据绝对的优势,在发酵菌液中还检测到了厚壁菌门,蓝藻和放线菌等;科水平上,醋杆菌科(Acetobacteraceae)在生物膜和菌液中均占绝对的主导,在发酵菌液中也检测到了其他科如颤藻科(Oscillatoriaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)等;在属水平上,驹形杆菌属(Komagataeibactersp.)和葡糖杆菌(Gluconobactersp.)是该菌群中最主要的属,发酵菌液中也检测到了双歧杆菌属(Bifidobacterium)、柯林斯菌属(Collinsella)、肠产气杆菌属(Enterobacter)、魏斯氏菌属(Weissella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)等其他的属。另外,生物菌膜和发酵菌液中还存在大量未分类的属(生物膜中约33%,汤中34%)。

2.2.3 DNA宏条形码 DNA宏条形码分析技术是DNA条形码技术与高通量测序技术相结合的一种新的研究思路[42]。其操作步骤大体分为以下几步:样本采集,样本混合提取基因组DNA,PCR扩增条形码基因,高通量测序,生物信息学分析。DNA宏条形码技术具有测序效率高、通量大、成本低，对物种鉴定快速、准确，且能对不可培养微型生物进行鉴定等特点,这也使它在微生物群落研究中的应用中有着广泛前景[35]。DNA宏条形码技术已经被应用于红茶菌微生物群落的研究。Reva等[43]通过对细菌16S rDNA和真菌ITS的元条码数据集的分析发现,虽然不同培养条件下红茶菌微生物菌群的物种存在多样性,但是对细菌而言,在不同条件下红茶菌发酵过程中核心细菌的组成一直保持不变。而与细菌群落相比,真菌群落随生长条件的变化差异性则很明显,且真菌群落的丰度也因发酵条件不同而有差异。从而推测在红茶菌中存在的芽孢杆菌和假单胞菌属可能构成了天然的抗真菌抗生素环境。这一个发现对于解析细菌-酵母的共生关系及其对人体微生物系统的影响都有一定的意义。Coton等[17]通过对细菌的16S V1-V3区域和真菌(尤其是酵母菌)的26S DNA D1/D2区域的元条形码进行高通量测序分析,深入研究以红茶和绿茶为基质的工业规模的红茶菌发酵过程中细菌和真菌的群落多样性和动态变化规律,并发现了红茶菌发酵液体和生物膜中的细菌群落组成存在强烈的基质效应,这种基质效应的存在与较高水平的乳酸和乙酸直接相关,也可能与酸性耐受酵母物种如Dekkerasp.的存在有关,但是酵母群落却不存在基质效应。这些分析结果都将对红茶菌产品的生产过程优化、监控、品质稳定性起到重要作用。

2.2.4 寡核苷酸配型技术 高通量测序使微生物生态学家能够在时间和空间尺度上探索微生物群落动态,但是通常无法解决复杂微生物数据集里密切相关的生物之间在生态学上有意义的差异[44]。寡核苷酸配型技术是一种新颖的监督计算方法,与比较序列读数中的所有位点以评估相似性的分类或聚类方法不同,它仅利用最具鉴别力的信息,聚焦于通过香农熵(Shannon entropy)分析所揭示的可变位点来识别高度精细的分类单元[45-46]。因此,寡核苷酸配型技术可以被用来测定红茶菌微生物群落中亚显性群落的组成及多样性。Filippis等[47]使用oligotyping技术对红茶菌菌群中葡萄糖醋酸杆菌的亚属多样性进行分析。结果发现,虽然发酵温度似乎不影响属水平上显性细菌群落的组成,但是在亚属水平上存在两种不同的葡萄糖醋杆菌(Gluconacetobacter)。并且在发酵过程中这两种亚属的丰度与发酵温度密切相关。另外,通过Oligotyping技术也揭示了较高的温度会促进一些亚显性细菌群的生长,主要是厚壁菌门(Firmicutes，包括乳杆菌属、乳球菌属、链球菌)和放线菌门。而这种不同温度下亚属性微生物的差异也造成了红茶菌发酵液中代谢产物的差异,尤其是主要代谢产物葡萄糖酸和葡萄糖醛酸以及多酚类物质。通过Oligotyping揭示出了红茶菌茶发酵过程中通过温度调节可以选择性地驱动不同醋酸菌亚种,从而调节红茶菌发酵液中产物的组成与浓度。这对于红茶菌产品品质的调控及稳定性具有重要的意义。

3 总结与展望

当前消费者越来越倾向于无添加剂、高营养价值和具有健康益处的“最小加工产品(minimally processed products)”。在这种背景下,红茶菌引起了国内外研究者和消费者的关注。红茶菌中微生物群落之间强大的共生关系及其丰富的代谢通路使其具有丰富的生物活性物质,并对多种疾病产生了潜在的治疗效果。但是作为一种复杂的微生物及其代谢产物的混合物,红茶菌中微生物群落组成及变化规律、代谢产物及其理化性质的研究一直以来仍然是国内外研究人员关注的焦点和热点。这也是从根本上保证产品的品质、安全性和稳定性的关键问题。

近年来,红茶菌中微生物的研究也从传统的依赖培养的单个微生物的分离、筛选、驯化,发展到依赖现代分子生物学技术的非培养依赖法的微生物群落分析。从单一的高通量测序以及以高通量测序为基础的T-RFLP技术、DNA宏条形码技术、寡核苷酸配型技术等,为深入全面认知和解析红茶菌微生物群落提供了方法和技术平台。而这些分析方法在获取微生物多样性信息方面各有优劣,因此为了获取更加全面、准确的微生物群落组成、结构及变化等信息,需要结合实际研究目标,采取多层次多角度的研究手段,通过多种分析方法的互补实现准确、完整解析微生物群落及其代谢产物的动态变化过程。从而实现红茶菌发酵过程中产品品质、安全及稳定的可控性。

目前,应用分子生物学技术对微生物多样性的研究得到了空前发展。尤其是随着新一代测序技术的推出和生物信息学的发展,迄今为止,越来越多复杂生态环境,如土壤、海洋、水体、肠道等中的微生物多样性被解析[48-49]。但这些技术很多还没有应用于红茶菌微生物多样性的研究中,例如以比较基因组学的方法研究红茶菌中微生物的水平基因转移,以确定发酵体系中的有利基因与有害基因,更好地控制红茶菌潜在的食品安全等问题;利用全基因组数据进行全基因组规模的代谢网络重构,对微生物群落的代谢能力进行预测和模拟,实现菌株的改造或者发酵过程的优化等。