基因编辑技术的发展及其在农业生产中的应用

何利娟，徐如梦，李冬月，郑超，郑二松，梁伟芳，周洁，杨勇，陈剑平，王栩鸣，严成其,3

1.浙江师范大学 生化学院，浙江 金华 321000；2.浙江省农业科学院，浙江省植物有害生物防控重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021；3.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040；4.云南农业大学，云南 昆明 650201；5.西北农林科技大学，陕西 杨凌712100

随着系统生物学、分子生物学等学科的快速发展，全球农业科技正在发生显著变化。大规模基因资源发掘和利用有了系统性的理论与坚实的分子生物学技术作为基础。基因分析、细胞工程、染色体工程、分子标记辅助选择、基因克隆与转基因等技术已经成为高效种质创新的主体策略。分子设计育种将提供大量突破性品种并催生智能植物品种的诞生。传统育种和基因工程相结合培育新的植物品系已经成为主流研究手段。其中，以CRISPR/Cas9 为代表的基因组编辑工具发展尤为迅猛，已成为一项新兴的颠覆性技术。利用基因编辑改变作物产量、抗性等农业性状方面的科研报道层出不穷。从纯粹的技术手段上讲，利用分子生物学操作改良作物，尤其像水稻这样的模式生物的农艺性状已经没有不可逾越的技术障碍。然而，目前社会对转基因应用的安全性还普遍存疑，世界各国对转基因应用的管控也非常严格，而对基因编辑的监管也还有很多不甚明朗的地方。所以，从现实应用角度讲，当前基因编辑技术在农业领域如何从一项研究转化为可运用的技术，需要考虑更多的是社会的接受程度及相应产品的监管问题。

1 基因编辑

我们身处在一个遗传学高速发展的时期，遗传分析和遗传操作技术进步飞速。高通量DNA测序和基因组编辑等技术正在通过模式生物研究、遗传进化研究、食品工程改进、医学应用等方面影响人们的生活。传统的遗传学研究依赖于自发突变的发现和分析，孟德尔（Gregor Johann Mendel）、摩尔根（Thomas Hunt Morgan）和埃弗里（Oswald Theodore Avery）等先驱很好地展示了这一点。在 20 世纪中叶，Muller 和 Auerbach 证明通过辐射或化学处理可以提高诱变率[1-2]。但这些操作，如辐射和化学诱变，在基因组中产生的是随机变化的位点。20 世纪七、八十年代，在酵母和小鼠中产生了第一批靶向基因组变化[3-6]。从本质上来讲，基因组编辑所做的就是打断染色体DNA，而其关键在于这种打断是特异性针对特定位点的。DNA 双链断裂（DSB）发生后，细胞会采用DNA 修复机制对断裂点进行修复，修复过程中，目的基因会发生特定类型的突变或插入，从而实现基因编辑[7]。通常，修复机制导致非同源末端连接（NHEJ）和同源定向重组（HDR）2 种类型的修复。NHEJ 主要导致可变长度的插入和缺失突变，因此可用于敲除基因。HDR 通常依赖于未损伤的染色单体与同源序列的重组，HDR 基因打靶在高等真核生物细胞中不是一个有效的过程，通常只有大约1/100 万的细胞经历了所需的基因组修饰[8-9]。这种基因编辑有着非常大的潜力，但在目前技术条件下其非重组效率非常低，且还受其他相关技术的限制，因而其应用范围还比较有限[9]。

锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription acti⁃vator-like effector nuclease，TALEN）这 2 种DNA 结合蛋白也可以被工程化以编辑特定目的基因。ZFN 由锌指DNA 结合域与DNA 切割域融合而成，其编辑效率取决于核酸酶的DNA 亲和力和特异性。ZFN 技术已用于多种动植物的基因编辑，且在医学领域也显示出重大价值，用于多种病毒的编辑，是一种有效的抗病毒药物[10]。TALEN 源于人们对转录激活因子样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）的认识。最初在植物病原体黄单胞菌中发现TALE 能通过细菌Ⅲ型分泌系统被注入植物细胞，通过靶定效应因子促进细菌的侵染。基于其序列特异性结合能力，人们通过将其与FokⅠ核酸酶连接，创造了基因组编辑工具TALEN[11]。ZFN 和TALEN 技术都需要合成能够与特异DNA 序列结合的蛋白模块，这一步骤非常繁琐费时。CRISPR/Cas 技术则使用一段向导RNA 引导核酸内切酶到靶点处完成基因组编辑。与ZFN 和TALEN 技术相比，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术更加简单灵活，基本适应所有类型的细胞和生物体[12-13]。

1.1 ZFN技术

早期基于锌指核酸酶等方法的基因编辑技术又被称为基因打靶。ZFN 具有单独的DNA 结合结构域和DNA 切割结构域，即天然型IIS 限制酶FokⅠ具有物理上可分割的特性[14]。Kim 等的研究表明，可以通过用人工识别结构域替代天然识别结构域重定向切割位点[15-16]。ZFN的功能首先是在体外被证明的，作为嵌合型限制性内切核酸酶，其显示出明确的切割活性[17]。在非洲爪蟾卵母细胞中用合成的ZFN 进行的实验显示出非常高的切割和重组效率[18]。Bibikova 等此后又在果蝇中实现了靶向诱变和靶向基因置换[19-20]。在后继研究中，ZFN 又被运用到青蛙、大鼠、小鼠、水芹、烟草等各种生物的基因编辑中[4,21-26]。虽然在不同物种中基因编辑效率有所不同，但普遍在10%左右。值得一提的是，在针对植物的基因编辑实验中，相关技术手段更为多样化。有一些编辑是通过农杆菌介导转化，并利用病毒启动子控制相关编码序列来实现的[27-29]，也有采用直接DNA 转化[28,30-32]或者利用病毒作为载体的成功案例[24]。虽然大量报道证实了ZFN的靶向诱变效果，但在某些物种或细胞类型中却没有发现基因替换。例如在斑马鱼中，虽然ZFN的诱变效率明显很高，但未见有利用ZFN 实现基因同源替换的报道。采用共注射作为DNA 供体技术在实验中未发现问题，但该技术似乎无法实现靶位点的切割和重组。这些情况表明，DSB 修复机制在不同的细胞类型和发育阶段是不同的。ZFN 技术在大量物种中证明可行，其基因编辑效率也可以接受，但是其构建策略复杂，构建过程动辄需要2～3个月，后期筛选成本也比较大。

1.2 TALEN技术

由于基于ZFN的技术具有许多不足，且构建过程复杂，应用成本高，还存在较高的“脱靶”概率，因此，人们在不断积极探索新的基因组编辑方法。TALEN 就是其中的一种[33]。TALEN 系统的发展历史与黄单胞菌属细菌的研究有关。这些细菌是水稻、胡椒和番茄等作物的病原体，研究显示这些病原物会将TALE 分泌到植物细胞的细胞质中，从而影响植物的代谢过程，使其对病原物变得更加易感。

对TALE的进一步研究表明，它们能够通过模仿真核转录因子与DNA 结合并激活其靶基因的表达。TALE 由DNA 结合结构域、核定位信号和激活结构域组成[34]。早在2007，这些蛋白质与DNA 结合能力就已有报道[35]，之后2 组研究人员分别破译了TALE 蛋白识别靶DNA的代码[36-37]。证明DNA 结合结构域由单体组成，其中每一个单体结合一个核苷酸。单体由34 个氨基酸残基的串联重复序列构成，其中第12 和13 位是高度可变的（repeat variable diresidue，RVD），它们负责识别特定的核苷酸。TALE 简单的识别特性受到研究者的注意[38]。理论上，人工合成的TALEN 能够识别任何已知的基因组区域，进而引入双链断裂。惟一限制是靶序列的5'端之前需要碱基T。但这一缺点影响并不大，因为在大多数情况下，可以通过改变间隔序列长度来保证这一点。一旦进入细胞核，TALEN 就会与靶位点结合，而蛋白C 端的FokⅠ结构则会工作引入双链断裂，并最终实现基因编辑的目的[39]。

1.3 CRISPR/Cas9技术

在TALEN 技术问世后约2年，另一种基于CRISPR/Cas的基因组编辑系统被开发出来，其主要元件是非编码RNA 和Cas 蛋白。与嵌合TALEN蛋白不同，CRISPR/Cas 系统通过非编码RNA 识别靶位点，利用RNA 和DNA 之间互作来进行靶基因的锚定，形成的非编码RNA 和Cas 蛋白的复合物则会切割相应的基因位点。早在1987年，就在某些细菌基因中发现了一些奇特的重复序列[40]，而在接下来的近20年里，它们的功能一直未被弄清。直到2005年，细菌基因组测序才逐渐揭开了这些序列的神秘面纱。相关研究显示，许多微生物的基因组中都存在相似的核苷酸序列，即一些通过短回文重复序列分开的DNA 区域，被命名为规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。这些CRISPR 表达盒往往位于具有解旋酶和核酸酶活性的 Cas 基因附近[41]。2005年，3 个独立的生物信息学研究小组报告，CRISPR 表达盒中间区DNA 通常与许多噬菌体和质粒的DNA 同源[42-44]。2007年，在嗜热链球菌中的研究表明，细胞如果在CRISPR 基因座上携带与噬菌体基因组DNA 互补片段，会使其对噬菌体具有抗性[45]。

CRISPR 系统起源古老，在原核生物中广泛存在，87%的古细菌和48%的真细菌中都有它们的身影[46]。由于这个原因，CRISPR 系统在不同物种中显示出相当高的保守性。在大多数物种中，CRISPR 盒数量（1～18）、重复大小（23～37 bp）及间隔物的数量和大小（17～84 bp）都相当类似[47]。

自然界中，CRISPR 系统的保护机制形成分为3 个主要阶段。第一阶段，将进入宿主细胞的外源DNA 小片段插入宿主基因组的CRISPR 基因座，形成新的间隔区，间隔区侧翼有2～5 bp的保守序列 PAM（protospacer adjacent motif）[48-49]。新形成的间隔区总是插入CRISPR 表达盒前导序列之前富含AT的一头。这也是大多数CRISPR/Cas系统新靶标形成的方式[50-51]。第二阶段，是整个CRISPR 基因座的转录。基因座被转录为长的pre-crRNA（poly-spacer 前体 crRNA）。在大多数CRISPR/Cas 系统中，未成熟转录物加工为成熟crRNA（CRISPR RNA）是通过Cas6 内切核酸酶实现的[52-54]。crRNA 通常为 39～45 个核苷酸，其中含有一个间隔序列，而它们的末端则含有参与茎环结构形成的序列[55-56]。第三阶段，参与外源DNA或RNA的干扰。由crRNA 和Cas 蛋白复合物来实现，crRNA 负责互补识别靶标序列，Cas 蛋白则负责对其进行切割降解。

另一方面，病原物在与其宿主的长期协同进化过程中形成了针对CRISPR 干扰的保护机制[57]，因而在细菌和古细菌中存在多种CRISPR/Cas 系统。生物信息学研究显示，CRISPR/Cas 系统可分为3 种大类型和至少10 种亚型[41,47]。其中，从化脓性链球菌病原体分离的II-A CRISPR/Cas 系统使用最广泛。从这种细菌中发现了一组最小的Cas 基因，以及一种多功能的Cas9 蛋白。该蛋白既能对pre-crRNA 进行加工，也能对外源DNA 进行切割[47,58]。crRNA 加工还依赖于小的非编码RNA——tra-crRNA（trans-activating crRNA）。tracrRNA 分子与pre-crRNA 中的重复序列互补结合，形成双链体，然后在宿主细胞的RNaseⅢ与Cas9 复合体共同作用下切割双链体，形成含有20个核苷酸间隔序列的成熟crRNA。在Mg2+存在的情况下，Cas9 在crRNA的引导下，在靶基因座中产生双链断裂[59]。在实际应用中，我们还需要考虑CRISPR/Cas 系统的PAM 序列，常用的化脓性链球菌Cas9的靶DNA 必须含有序列为NGG的PAM，而在嗜热链球菌和脑膜炎奈瑟球菌中，Ⅱ型Cas9 对应的PAM 序列则分别为NGGNG 和NNNNGATT[59-60]。

2 基因编辑的应用

2.1 基因编辑在医疗领域的应用

基因组编辑已成为科研和商业、医学应用中广泛使用的工具，CRISPR/Cas 无可否认是其中最为便捷且应用最为广泛的一项技术。由于先前使用ZFN 和TALEN的研究取得了令人鼓舞的结果[61-62]，一些涉及基因组编辑的体细胞疗法已获准用于Ⅰ期临床试验[63-64]。相较于体细胞级别的治疗，种系编辑要更为激进，因为它能够将编辑传递至胚胎，导致疾病的基因位点永远地从被治疗的个体的血统中消失。但这样做的风险也非常大，因为纠正DNA 序列的尝试有可能是弊大于利的。而且，由于基因组中的突变不仅影响受治疗的个体，还会遗传给其后代，因而它们的效果还存在很大的不可预测性。由于CRISPR的编辑的易用性，基于该技术的种系编辑存在被滥用的可能，带来的一系列伦理问题也值得人们深思[65]。

2.2 基因驱动与基因编辑

基因驱动是一种基于基因编辑的基因工程技术。与普通的基因编辑相比，它能够快速地在整个种群中传播经过修改的基因。自然界也存在天然基因驱动，但目前研究者的兴趣主要集中在由CRISPR/Cas9 介导的基因驱动[66]。蚊子是很多热带疾病的载体，传播的疾病对人类生命和健康造成了威胁。目前已有针对蚊子开展利用基因驱动的研究，生产雌性不育的蚊子[67]或使蚊子群体无法传播疟疾[68]。基因驱动的好处比较直接：在公共卫生方面，可利用这种技术制造遏制登革热、疟疾和寨卡病毒传播的转基因蚊子；在农业方面，可通过该技术控制或修改那些破坏作物或携带作物疾病的物种。但是它对生态方面的影响却是非常深远的，即便是来自实验室的一次很小的、事故性的释放都有可能造成基因驱动的全球传播。此外，基因驱动技术还有可能带来意想不到的后果，比如对非目标物种造成破坏或制造出新的强势入侵物种。

2.3 基因编辑在农业方面的应用

CRISPR/Cas9 是目前获得广泛认可的专一性好、基因定点突变效率高的基因组编辑技术。作为新的基因定点编辑工具，其构建简单、成本低、快速且高效，已广泛用于牲畜和农作物的基因组编辑。从本质上讲，由基因编辑所产生的新品种都是经过基因改造的，属于广义的转基因范畴。但它们与早期的转基因生物又有重大区别[69]。大多数情况下，这些新品种没有引入来自其他物种的遗传物质，而且引入的变化通常在自然情况下也会发生。即使是利用基因编辑导入外源DNA，它们也是被精确地插入基因组的特定位置。因此，相比传统的转基因技术，其安全性高得多。

目前基因编辑作物的例子非常的多，包括高产水稻[70]、抗病小麦[71]、耐储存的马铃薯[72]和生产健康油料的大豆[73]等。畜牧产品方面也有很多成功案例，如缺乏角的奶牛[74]、绵羊[75-76]、携带更多肌肉的猪和其他食用动物[77]。基因组编辑具有优于育种选择的优势，即可以在一代中引入性状而不破坏有利的遗传背景。可以将相同的有益修饰引入适合于不同环境的不同品种或栽培品种。2016年，Nature杂志在报道中提到美国宾夕法尼亚州立大学科学家杨亦农利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的工程化蘑菇已经开始种植售卖，而美国农业部并没有对这种新型CRISPR/Cas9 基因编辑蘑菇进行管制。美国农业部认为不需特殊监管程序来监管这种蘑菇的培养和售卖。此外，还有几十种基因修饰生物（genetically modified organisms，GMO）（大多数是植物）也被美国农业部认可无需特殊监管[78]。这些通过编辑进行精确基因组修饰的产品是否会比早期的转基因生物更易获得公众认可，还有待观察。

2.4 CRISPR/Cas9技术在水稻育种中的应用前景

全球有超过30 亿人每天摄取大米，水稻所提供的能量约占世界膳食消耗总能量的20%[79]。由于水稻具有广泛的适应性，因此，它的生产是事关全球粮食安全的战略性议题[80]。随着基因编辑技术的快速发展，CRISPR/Cas9 技术在水稻基因功能研究方面有了长足发展。采用CRISPR/Cas9技术编辑水稻基因组，改变水稻的各种农艺性状，已不再具有不可逾越的技术障碍。过去的几十年中，传统的突变体筛选和分子辅助育种为水稻生产做出了巨大贡献。然而目前，水稻生产面临诸多新挑战，如人口快速增长、全球气候变化，以及由此衍生的新的病虫害及其他环境问题。因此，迫切需要更先进的技术和方法来创制水稻新品种，使其具有更高的产量、更好的生物/非生物胁迫耐受性。

从2013年起，有大量关于CRISPR/Cas9 系统在水稻中成功定向诱变的报道[81-85]。其中部分研究还显示，相比于TALEN，CRISPR/Cas9 系统诱发的突变频率更高[84]。在作物中，产量、质量和胁迫响应等农艺学性状往往由多个基因共同控制，因此有不少探究水稻多靶点基因编辑方法及效率的研究。实际结果非常鼓舞人心，基于CRISPR/Cas9 构建的三靶点、四靶点的基因编辑都获得了成功[81,86-87]。这些研究清楚地表明CRISPR/Cas9 系统是水稻染色体工程的高效工具。Ma 等的一项研究还测试了基因组编辑效率[88]，在水稻基因组中编辑的46 个目标位点平均突变频率为85.4%。该研究还同时编辑了OsWaxy 基因内的3 个位点，使编辑后的材料直链淀粉含量降低了14%。此后，Liang 等开发了水稻 CRISPR/Cas9-sgRNA 多重编辑系统新策略，设计了21 个sgRNA，其中82%的目标位点显示缺失、插入、取代和倒位，显示出CRISPR/Cas9 优秀的编辑效率[89]。所有这些研究表明，CRISPR/Cas9 系统能够高效地产生单个或多个基因突变，可用于加速水稻育种。

CRISPR/Cas9 技术为水稻从基础研究到生产应用的衔接提供了桥梁，能为水稻育种实践提供更直接的助力，有着极其广阔的应用前景。更重要的是，CRISPR/Cas9 技术在水稻中的应用具有很强的实用性，比如针对水稻抗病性的研究和产量方面的研究。水稻对东格鲁病的抗性与翻译起始因子4γ基因（eIF4G）密切相关，利用CRISPR/Cas9 产生突变后，敏感品种IR64 也能获得对东格鲁病的抗性，从而提高水稻产量[90]。研究显示，采用 CRISPR/Cas9 系统同时对 Grain Width2（GS3）、Grain Width（GW5）和 Grain Width（TGW6）进行编辑，能够显著增加谷粒重量[91]。朱健康院士团队利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术编辑ABA 受体基因，提高了水稻产量[70]。

3 基因编辑的优势及面临的问题

常规转基因技术普遍采用的方式是通过导入外源基因来实现相关性状的改良。这种操作会向作物基因组导入3 类外源物质：一是目标外源基因，二是用于调控目标基因表达的相关元件，三是转基因筛选标签[92]。其中，外源基因又可以从亲缘关系上分为多种情况。例如，向水稻导入不同品种的基因、导入同族的野生稻基因、导入其他物种基因等。而表达调控元件和转基因筛选标签更是五花八门，各种各样。正是由于这种纷繁复杂的情况，导致了转基因产品管理的复杂性，也使得社会和科学共同体内部对转基因应用的安全性存有挥之不去的疑虑。这些担心也是很好理解的，因为任何一部分外源物质导致的不可预知的后果，都会影响到转基因产品整体的安全性。这些担忧也是农业转基因生物技术应用的主要阻力之一。

以CRISPR/Cas9 为代表的基因编辑技术与传统的转基因技术有着很大的差别。从本质上来讲，它们的生物学功能是切割降解DNA，因此，CRISPR/Cas9 基因编辑技术非常适合于对特定目标基因的特定位点进行剪切，造成单核苷酸级别的改变，从而改变作物的原有基因功能。当然，CRISPR/Cas9 或其他方法介导的双链断裂后的DNA 修复过程都取决于细胞的修复机制。NHEJ在连接断裂DNA 时会引入一些突变，而大多情况下高等真核生物NHEJ 产生突变，而非插入DNA片段。因此，如果目标仅仅是敲除蛋白质编码序列，这样的编辑效率是比较高的。当然这一技术也能用于外源DNA 片段导入，只是效率较低，成本较高[93-94]。值得一提的是，对于非插入型的应用，在基因编辑完成后，可以从分离的后代中找到完全没有任何外源片段的材料，这也是大家追求的结果。就目前的报道来看，包括CRISPR/Cas系统和ZFN、TALEN 在内的基因编辑方法的有效性都很好，但它们的特异性都不完美，均存在脱靶问题，而且有潜在的产生一系列脱靶效应的可能，引起基因组的重排或无法预测的突变，甚至会导致细胞死亡[95]。人们对脱靶的关注程度取决于应用。在医学应用上这个问题相对严重，因为脱靶导致的无法预测的结果有时是无法接受的。当然如果脱靶不会引发新的临床病症的突变，它们并非不可忍受。在农业应用，尤其是作物基因编辑方面，由于不涉及伦理问题，这一缺点就不是非常明显。因为研究者可以对作物的基因组进行完整测序，并且可以彻底分析突变材料的表型，从而排除那些无效或有害的突变。

4 结语

随着CRISPR/Cas9 基因编辑技术的飞速发展，人们变得越来越关注这一技术的伦理和社会影响。在医学领域，如何限定基因编辑技术的应用显得非常令人困惑。当然，针对某些破坏性疾病，如亨廷顿病和肌肉萎缩症，显然社会比较容易形成共识；但如果是身材矮小、运动能力低下这些问题，则回答就会模糊得多。更进一步，头发颜色、眼睛颜色、身高、肤色，这些方面是否允许做人为改变，则涉及更深层次的伦理问题，一定会引起更广泛的争论。所幸的是在农业应用方面这些问题不那么尖锐，因为农业产品尤其是作物往往很少涉及伦理问题。但监管方面的争论依然十分激烈。目前欧盟对转基因和基因编辑的监管在全球来讲相对比较严格，其法律要求任何基因改造的作物都必须是可检测的，且遗传变化必须与传统育种技术具有相同的稳定性。但欧盟内反对转基因群体的呼声一直也很高，这些群体认为转基因技术有可能产生“非自然”的危害，因为它们不是生物体的“正常”部分，基因编辑同传统的转基因一样应该受到严格监管。但是像CRISPR/Cas9 这样的新技术又显得非常不同，因为所有的基因编辑变化虽然都是可检测的，但这些改变与其他传统的育种方法，如辐照诱变、化学诱变引入的变化无法区分。因此，在争论还在继续的情形下，政府与国家层面的规范和立法对该技术未来的发展至关重要。