神经菌毛素1在恶性肿瘤治疗中的相关研究进展

张海霞

扬州大学 广陵学院，江苏 扬州 225000

癌症是最常见的死因之一，它以多种方式出现，具有个体特异性，几乎每个病人都不同。虽然癌症的病因复杂而且难以捉摸，但事实上它的产生方式主要只有3种：基因缺陷的积累、致癌的环境以及先天性遗传。而在肿瘤产生过程中，细胞生长状态、细胞存活率和基因组稳定性会受到严重影响。机体自身调节过程中涉及12种信号传导途径，大约使用到140个基因[1]。其中，神经菌毛素（neuropilin，NRP）对细胞生长及存活状态特别重要。NRP作为酪氨酸激酶的辅助受体参与多种信号通路，而这些信号通路又参与血管生成过程，对于血管生物学功能至关重要。神经菌毛素蛋白1（NRP1）是NRP家族的重要一员，在神经发育，血管生成，肿瘤侵袭、转移和免疫等方面发挥重要作用。当NRP1作为血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族的共受体时，可以发挥结合或调节其他细胞外配体的功能[2]，如 3 型 Semaphorin3（Sema3）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）家族成员（FGF-1、FGF-2、FGF-4）。VEGF165和 Sema3可以通过被称为C端规则的基序（CendR基序：R/KXXR/K，其中X是任何氨基酸）内的C端精氨酸残基与NRP1 b1结构域的多核苷酸相互作用[3]。此外，研究表明NRP1也可以通过血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）介导血管平滑肌细胞迁移，进而促进血管生成[4]。由于NRP1在多种肿瘤细胞中的异常表达对肿瘤的发生发展起到病理性促进作用，所以NRP1对于肿瘤的发生发展是至关重要的。在此，我们简要探讨NRP1在肿瘤侵袭和转移中的作用，以及以NRP1为靶点治疗恶性肿瘤的相关研究进展。

1 NRP1的基本结构

NRP1基因位于染色体10p12，长约112 kb，由17个外显子组成[5]。NRP1蛋白相对分子质量为 120×103～130×103，为多功能单次跨膜糖蛋白，由胞内区、跨膜区和一个长的胞外区组成，胞外区又分为a1a2、b1b2和c等3个结构域[6]。a1a2大约含有220个氨基酸残基，Sema3A可与a1a2、b1结构域结合；b1b2大约含有300个氨基酸残基，VEGF165通过b1b2结构域与NRP1结合，具有刺激肿瘤血管内皮细胞迁移和增殖的作用，诱导肿瘤内新生血管的生成，进而起到促进肿瘤发生发展的作用[7-8]；c端可以与跨膜区同时介导Sema3A的下游信号，发挥各种生物学过程，如轴突导向、血管生成和肿瘤免疫反应。NRP1已被确定在人类多种恶性肿瘤中高表达[9]，而在相应的正常组织结构中的表达量较低。多种肿瘤细胞的生长活力与NRP1的表达密切相关，在各种晚期肿瘤中NRP1的丰富表达可以证明这一理论[10-11]。因此，人们对NRP1的靶向治疗关注度与日俱增。

2 NRP1作为辅助受体，增强促血管生成活性

NRP1首次发现于中枢神经系统的神经元细胞，特别是在发育中胚胎的神经元细胞的表达更为明显。此外还发现NRP1可以在不同组织的血管中表达，特别是动脉血管。随着个体的不断发育，NRP1在动脉内皮细胞和肿瘤血管系统中表达，但不在静脉或淋巴内皮细胞上表达[12-15]。NRP1作为VEGF165辅助受体的作用已被人们所熟知。在内皮细胞中，NRP主要通过确保VEGF的最佳呈递以及稳定VEGF/VEGFR（VEGF受体）通路的方式增强信号传导。因此，VEGF165与VEGFR-2的稳定结合及VEGFR-2完全活化需要VEGF165与NRP1的相互作用来实现[16-17]。

遗传学研究表明，在小鼠体内过表达NRP1或靶向失活NRP1基因对于小鼠来说都是致命的，这不仅可以引起神经缺损，还会导致血管网络缺陷以及心脏发育解体的严重缺陷[15,18]。但是当NRP2基因失活时却不会引起太严重的后果，仅导致小鼠小淋巴管和毛细血管缺陷形成[13]。然而，在NRP1与NRP2基因型双敲除的小鼠体内会发生很严重的血管表型并且导致胚胎8.5 d后死亡[19]。因此，NRP对于血管发生、血管生成和淋巴管生成是必不可少的。

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是具有着多种功效的细胞因子，能够有效促进血管生成。HGF的N端能与NRP相互作用，C端能与靶细胞结合。结合后，HGF诱导c-met磷酸化，导致几个下游信号转导因子（包括Grb2、Gab1、STAT3、Shc、SHIP-1、Src和磷脂酰肌醇-3）的募集[20]，进而引起Ras细胞外信号调节激酶级联通路特异性刺激，激活丝裂原活化蛋白激酶家族中的某些成员。HGF主要通过c-met调节内皮细胞的存活、增殖、迁移，基质沉积和降解，以及毛细管样结构的形成[21]。有2项研究证明NRP1可以通过增强自分泌HGF/c-met通路的方式在肿瘤进展中发挥新作用[22-23]，这表明可能NRP1也可以作为HGF的功能性受体发挥作用。在体内实验中，HGF在多种缺血动物模型中刺激血管生成的效率与VEGF165相似甚至更高，表明NRP1对VEGF165和HGF有着相似的亲和力。用siRNANRP1干扰内皮细胞NRP1的表达量会引起HGF诱导的c-met磷酸化水平降低，VEGF165和HGF介导的细胞内信号传导受到显著抑制。同样地，在小室迁移实验中加入抗NRP1抗体能够强烈抑制HGF及VEGF165诱导的HUVEC细胞的侵袭以及血管生成。这些结果表明，NRP1不仅可以增强VEGF165和HGF在血管内皮细胞内的表达量，还可以影响内皮细胞的增殖、迁移，进一步影响血管的生成。

3 阻断NRP1可以增强抗VEGF疗法的抑制肿瘤生长作用

NRP1功能的缺失可导致血管重塑和分支缺陷[18]，同时加上NRP2功能的丧失会进一步增强血管表型的损失[21]。这些结果表明，在发育早期NRP1和NRP2可能具有重叠的功能。但是，在发育后期每个NRP被分配了不同的功能，NRP1主要表达在动脉而NRP2则在静脉和淋巴管[24]。作为VEGFR-1和VEGFR-2的共同受体，NRP1可以调节VEGF信号传导，并且以VEGFR非依赖性方式作为丛蛋白A（plexin-A）的共同受体，介导Semaphorins的化学吸收活性[16,25]。实体瘤的癌细胞可以表达不同水平的VEGFR-1，但很少表达VEGFR-2和VEGFR-3，可能这就是它们主要通过NRP1结合VEGF-A的原因[26-29]。

有研究制备了一种可以和VEGF结合域结合的NRP1单克隆抗体，这种抗体可以减少血管发生和血管重塑，但不会对VEGFR-2介导的其他活动造成影响。通过小鼠视网膜血管重构模型研究发现：①单独使用这种抗NRP1单抗治疗时，对于小鼠视网膜血管重塑有一定的阻碍作用；②单独使用抗VEGF治疗时，对于小鼠视网膜新生血管的复原有阻碍作用；③联合使用时，NRP1可能可以通过除了提高VEGFR-2信号传导以外的机制调节内皮细胞功能，而且阻断NRP1功能对VEGFR-2信号传导影响不大[30]。SK-MES-1是一种非小细胞肺癌异种移植模型。利用该肿瘤模型，发现阻断NRP1功能的同时结合抗VEGF治疗能改变肿瘤血管形态，并进一步降低微血管密度。在单独使用抗VEGF治疗的肿瘤中可见血管改变明显，血管密度显著减少，并且与周围细胞有着非常密切的关联[31]。用抗NRP1和抗VEGF组合治疗的肿瘤中血管与周围细胞联系更加密切，同时表现出比单独使用抗VEGF治疗肿瘤更明显的血管密度降低。

这些数据表明，NRP1可能通过其他除VEGF/VEGFR外的通路参与血管的发生发展。说明阻断NRP1功能可以成为提高抗VEGF抗血管生成治疗肿瘤的一个有用的方法。

4 Sema3A/NRP1信号阻断与抗肿瘤免疫相关

Semaphorins是一个蛋白质家族，Sema3是一种分泌蛋白，NRP1可以作为其受体。Sema3A与NRP1的a1a2串联结构域结合，可以导致神经生长锥的塌陷和回缩[32]。Sema3A起初被认为是轴突进化的初始因子，现发现在抑制内皮细胞及肿瘤细胞迁移方面也有重要作用。但是Sema3A须与plexin-A1、NRP1形成共受体复合分子，才能进一步介导胞内信号转导。缺氧条件可以诱导Sema3A作为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMS）的吸引剂，通过NRP1和plexin-A1/plexin-A4组成复合受体，触发VEGFR-1磷酸化[33]。虽然有数据显示NRP1在缺氧环境中表达量会下调，但Sema3A可以以不依赖NRP1的方式介导plexin-A1/plexin-A4继续调节TAMS。同样，当巨噬细胞中的NRP1基因缺失时，TAMS在正常氧化肿瘤区域中仍然发挥减弱血管生成和免疫抑制功能，从而抑制肿瘤生长和转移。这表明TAMS的异质性取决于其所处环境，由Sema3A/NRP1信号严格控制。无血管/缺氧区域的TAMS代表着一种致命的组合，因为TAMS可以通过改变基因表达谱响应缺氧，形成一种有利于血管生成、转移并抑制抗肿瘤免疫反应的独特表型[34]。

NRP1在生理条件下是促血管生成性M2型巨噬细胞的标志物。虽然NRP1不直接参与TAMS的募集，但可能参与TAMS进入缺氧区域，并且NRP1缺失可以引起TAMS的再分布，进而阻滞原位性和自发性肿瘤的发生。此外，Sema3A主要通过以NRP1依赖的形式吸引巨噬细胞，同时在同一细胞中当NRP1的表达量下调时Sema3A会表现出抑制巨噬细胞迁移的效应。这些结果表明，肿瘤细胞衍生的Sema3A主要负责TAMS通过NRP1信号进入缺氧区域[35]。与Sema3A介导的吸引或排斥巨噬细胞一致，Sema3A的表达与肿瘤进展和肿瘤抑制相关[36-37]，揭示了Sema3A/NRP1信号通路在巨噬细胞进入缺氧区域的指导作用，以及逃避抗肿瘤免疫并促进血管生成的能力。

5 抗原呈递细胞基因甲基化可以调节NRP1蛋白表达

树突状细胞（dendritic cells，DC）是目前所知的功能最强大的专职抗原呈递细胞，分为2个主要的细胞系，即浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）和常规DC（conventional DC，cDC）。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。在一组分析有关增强细胞间相互作用的基因实验中，以高剂量NRP1热激蛋白免疫的小鼠体内显示出基因甲基化现象，确定了基因甲基化与NRP1蛋白表达存在关联。并且这种现象只在以高剂量热激蛋白免疫的小鼠样品中看到，在以低剂量热激蛋白免疫的小鼠样品中未能观察到[38-44]。为了确定基因甲基化对NRP1蛋白表达的影响，该实验室采用不同剂量的NRP1热激蛋白免疫小鼠，18 h后取出小鼠的淋巴结细胞分别标记pDC和cDC，分析NRP1的表达情况。发现无论以任何剂量的热激蛋白免疫，cDC中NRP1的表达量都没有增加，但当小鼠免疫高剂量的热激蛋白时，NRP1+pDC的百分比显著增加。当分别用高剂量和低剂量热激蛋白体外联合培养pDC后，通过流式细胞术检测pDC表面NRP1的表达情况，统计结果与体内现象一致，即当使用高剂量的热激蛋白处理时，NRP1+pDC的百分比明显增加。通过qPCR实验，测定分别以低剂量和高剂量热激蛋白处理的pDC中NRP1的mRNA表达量，结果显示mRNA表达情况与蛋白表达情况一致，当使用高剂量的热激蛋白处理时，NRP1的mRNA表达水平明显升高，这些结果表明抗原呈递细胞基因甲基化对NRP1蛋白表达有上调的作用。为了验证上述结论，该实验室在进行流式细胞分析小鼠体内pDC前，在小鼠体内注射一种能有效抑制DNA甲基转移酶的蛋白，然后与未使用抑制剂的对照组做比较。结果发现，使用了抑制剂的小鼠体内pDC再次用高剂量的NRP1热激蛋白孵育后NRP1的表达上调现象被完全阻断了。

调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群。有文献报导pDC与Tregs间的相互作用可以促进NRP1的表达[45-47]，用高剂量NRP1热激蛋白培养pDC，18 h后将Tregs用红色标记物标记，然后用延时活细胞显微镜测量，每15 min间隔拍摄，发现用大剂量的NRP1热激蛋白处理可以显著增加pDC与Tregs间的相互作用时间，并且这种相互作用可以被NRP1抗体阻断[38]。将普通T细胞和Tregs以上述相同方法处理后与pDC共培养，发现pDC与普通T细胞之间的相互作用时间没有变化。表明这个现象是Tregs特异性现象，而且普通T细胞不高表达NRP1，说明这种现象属于NRP1依赖性，因此通过NRP1热激蛋白刺激pDC，引发抗原呈递细胞基因甲基化，可以增加NRP1的表达，延长pDC与Tregs间的相互作用，为研究肿瘤的发生发展提供了一个新的方向。

6 人体肿瘤的不良预后与NRP1+/+Tregs增加有关

Tregs是人体内重要的控制自身免疫反应的细胞，其表达的FOXP3转录因子可以维持免疫稳态，防止过度的组织损伤，缺乏功能性Tregs的人会发生致死性的自身免疫性疾病。有数据显示通过抑制抗肿瘤免疫会限制自身免疫和维持免疫调节[48]。之前已有文献报道，肿瘤小鼠模型中90%的NRP1由肿瘤浸润性Tregs表达，并且对它们在肿瘤微环境中的功能至关重要[49]。Tregs的脆弱性是指敲除了NRP1的Tregs（NRP1-/-Tregs）是不稳定的，虽然仍保留了表达FOXP3转录因子的能力，但是失去了体外抑制活性。虽然在小鼠体内NRP1已被证明可以阻断Tregs的脆弱性，但其在人类Tregs中的存在情况和作用机制尚不清楚。以前的相关研究一直存在争议，一些人认为人类外周Tregs不表达NRP1，而另一些人则认为NRP1+/+Tregs是肿瘤的强效抑制剂[50-54]。分别使用NRP1-/-及NRP1+/+Tregs细胞在黑色素瘤小鼠模型内进行评估，发现高比例的NRP1-/-Tregs可以产生γ干扰素，进而驱动肿瘤组织周围的野生型Tregs的脆弱性，促进抗肿瘤免疫。

收集临床肿瘤病例与健康人进行比较，发现NRP1+/+Tregs的表达与肿瘤的不良预后相关。通过条件性细胞剔除的小鼠模型发现如果减少小鼠体内一半的Tregs数量，肿瘤就会不受限制生长；相反，如果敲除一半Tregs上的NRP1，则肿瘤的生长会受到限制，表明NRP1-/-Tregs在重塑肿瘤微环境中有积极作用。并且NRP1-/-Tregs对NRP1+/+Tregs肿瘤抑制功能有负调节作用。据报道，NRP1与Sema4a相互作用可以加强Tregs的功能和生存[51]。为了确定在阻断NRP1/Sema4a通路后，γ干扰素及其受体是否也有表达，用Sema蛋白对B16细胞荷瘤小鼠进行治疗，发现肿瘤组织变小，γ干扰素及其受体的表达增加。证明γ干扰素及其受体的表达确实与NRP1的敲除相关[55]。事实上除了NRP1的缺失可以导致Tregs的脆弱性，细胞外部的环境因素也是导致肿瘤内Tregs脆弱性的原因[56-57]。

以上数据表明，Tregs在肿瘤中可能是有害的，通过免疫抑制功能，它们能够阻止免疫系统检测和杀死癌细胞；另外，NRP1蛋白几乎在所有浸润的小鼠肿瘤细胞中的Tregs上都有表达，NRP1可以通过抑制天然的抗肿瘤免疫，帮助肿瘤细胞存活；在小鼠体内阻断或敲除Tregs上的NRP1，只影响其在肿瘤中的功能，并不影响Tregs在机体其他部分的作用；当Tregs失去NRP1后，它们不仅有免疫抑制作用，还能成为抗肿瘤免疫的积极参与者。预后较差的癌症患者中NRP1+/+Tregs亚群的表达水平较高。

7 结语

随着对NRP1在肿瘤血管生长、肿瘤细胞转移、肿瘤组织免疫等方面作用机制的深入研究，NRP1的作用越来越多地被发现，同时越来越多的作用机制和通路也被发掘。增强NRP1作用的靶向性日趋成为人们关注的重点。构建特异性单链抗体被证实可以作为全长单克隆抗体的替代选择，它提供了更低的免疫原性，改善了药代动力学特性，可以更好更快地渗透到肿瘤部位。细胞穿透肽作为一种肿瘤穿透肽可以通过NRP1的依赖性外渗作用提高肿瘤物质的递送。2010年发表的肿瘤穿透肽IRGD应用于抗肿瘤药物递送系统中，可以增加抗肿瘤药物的肿瘤渗透能力，减少毒副作用。现已证实通过循环肿瘤穿透肽与NRP1的相互作用可以启动血管的转胞吞作用途径，大大提高了肿瘤的靶向治疗效果。iRGD与纳米颗粒白蛋白（nab）-紫杉醇结合物和吉西他滨联合治疗转移性外分泌胰腺癌已于今年开始Ⅰ期临床试验。相信NRP1在肿瘤发生发展中的重要作用终将会在人类对抗肿瘤的战役中扮演举足轻重的角色。