山东道地药材全蝎HPLC指纹图谱研究

，，

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

中药全蝎为钳蝎科(Scorpion)动物东亚钳蝎Buthus martensii Karch 的干燥全体，具有熄风镇痉，通络止痛，攻毒散结的作用，临床多用于治疗小儿惊风、抽搐痉挛、中风、半身不遂、破伤风等症状[1]。现代研究表明，全蝎中化学成分具有抗肿瘤、抗菌、消炎等药理作用[2-4]。中药指纹图谱作为一种对中药多组分、多靶点整体分析的有效手段，具有系统性、特征性、模糊性和稳定性的特点，成为国内外认同的现代中药质量控制方法[5-7]。全蝎作为大宗动物类中药，目前药典收载的全蝎质量标准中仅有“性状”、“显微鉴别”、“浸出物”三部分，不能全面反映全蝎内在质量，因此可以考虑建立全蝎HPLC指纹图谱，为全蝎质量控制标准的制定提供数据支持。本实验采用液相色谱法，对全蝎不同产地10批样品建立 HPLC指纹图谱，为全蝎的质量控制提供了一种直观、简便、有效的手段，为全蝎的成分研究和质量控制提供参考依据。

1 仪器、试剂和药材

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(检测器型号：UV-L2400，日立公司)；色谱柱(ZORBAX SB-C18柱，粒度5μm，4.6×250mm×4.6mm，美国安捷伦科技公司)；乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，批号：20120823)；甲醇(色谱纯，天津市四友卓越科技有限公司，批号：20121206)；磷酸(分析纯，天津科工工贸有限公司，批号：100726)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA)；纯净水(娃哈哈公司)。

1.2 供试药材

实验中所有供试全蝎药材分别采于山东省济南千佛山、泰安泰山、济南长清、烟台龙口、淄博沂源等地的山区，均为野生活蝎，选择成年蝎，剔除幼蝎，放到清水中冲洗干净捞出，晾晒干燥，置-18℃冷冻72h，4℃低温保存。药材经山东中医药大学中药鉴定学教研室李峰教授鉴定，符合《中国药典》2015年版一部规定，为正品全蝎。

2 方法和结果

2.1 全蝎HPLC指纹图谱的建立

取山东淄博沂源全蝎样品，粉碎过100目筛，精密称取药材粉末0.1g，置于锥形瓶中，分别选用25mL水、甲醇、乙醇、石油醚为提取溶剂，超声振荡提取30min，过滤，溶剂蒸干，以甲醇定容至5mL，0.45μm微孔滤膜滤过，进行HPLC分析。

色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱，粒度5μm，4.6×150mm×4.6mm，美国安捷伦科技公司，柱温25℃，流动相为乙腈-水，流速1mL/min，进样量20μL，检测波长为210nm，洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

2.2 供试品溶液的制备

取全蝎冻干粉过100目筛，精密称取药材粉末0.1g置于锥形瓶中，25mL80%乙醇，超声提取30min，过滤，溶剂蒸干，以甲醇定容至5mL，0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.3 方法学考察

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，对10批不同产地全蝎药材进行HPLC检测，根据中药指纹图谱相关技术参数：保留时间、相对保留时间、色谱峰高、色谱峰面积、相对峰面积百分比等。其中，相对保留时间和相对峰面积百分比是中药指纹图谱的核心参数，是评价中药指纹图谱的重要指标。以出峰时间、峰面积较为稳定的16号色谱峰作为参照峰，进行其他色谱峰RRT、RA的计算。

2.3.1 精密度试验

精密称取样品粉末0.1g，按上述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积占总峰面积1%以上的色谱峰的相对保留时间及峰面积。结果表明，峰面积占总峰面积1%以上的色谱峰19个，其相对保留时间的RSD值为0.072%～0.920%，峰面积的RSD值为0.293%～2.578%，均在3%以内，符合指纹图谱技术要求。

2.3.2 稳定性试验

精密称取样品粉末0.1g，按上述色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10 h进样。结果表明，峰面积占总峰面积1%以上的色谱峰19个，其相对保留时间的RSD值为0.074%～0.823%，峰面积的RSD值为0.572%～2.638%，均在3%以内，符合指纹图谱技术要求。

2.3.3 重复性试验

精密称取样品粉末0.1g共6份，分别按上述色谱条件测定。结果表明，峰面积占总峰面积1%以上的色谱峰19个，其相对保留时间的RSD值为0.146%～1.084%，峰面积的RSD值为0.765%～2.750%，均在3%以内，符合指纹图谱技术要求。

2.4 HPLC指纹图谱的建立

取不同产地lO批全蝎药材，按2.2项供试品溶液的制备方法与2.1项色谱条件测定，记录HPLC色谱图，采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)"进行匹配和相似度分析，所得匹配图谱见图1、图2。利用对所得HPLC图谱进行了共有峰的比对和标定，排除阴性对照峰，确定19个共有特征峰，其共有峰面积占总峰面积的90%以上，选择出峰稳定性、分离度良好的16号色谱峰为内标参照峰。

注：1：济南千佛山 2：济南千佛山 3：泰安泰山 4：泰安泰山 5：济南长清 6：济南长清 7：烟台龙口 8：烟台龙口 9：淄博沂源 10：淄博沂源

图1 不同产地全蝎药材的HPLC色谱图比对

图2 不同产地全蝎药材的HPLC对照谱图

2.5 共有峰面积与非共有峰面积

以16号峰为内标参照峰，设峰面积为1，计算其他各共有峰的相对峰面积比值，分别为0.0925、0.1448、0.2296、0.3738、0.7045、0.8446、0.0282、0.0324、0.1026、0.0166、0.0211、0.2798、0.6653、0.0243、0.3685、1、0.0525、0.0184、0.2214，并将其数据作为全蝎指纹图谱的鉴别特征。计算10批样品图谱中非共有峰面积占总峰面积的百分比，依次为9.18%、8.24%、9.44%、7.49%、9.18%、7.47%、8.99%、9.68%、6.23%、6.00%，均小于10%，符合中药指纹图谱要求。

3 讨论

本研究通过对不同产地全蝎药材HPLC图谱的比对，建立了全蝎药材的HPLC指纹图谱，共确定了19个色谱共有峰。选择出峰稳定性、分离度良好的16号色谱峰为内标参照峰。19个共有峰面积均占总峰面积的90%以上，可见实验所建立的全蝎HPLC指纹图谱能够较为全面的反映全蝎化学成分的分布，且能整体上反映全蝎药材质量的优劣。

由于本研究缺乏对照品和供含量测定使用的对照药材，加之实验时间、实验条件的局限，所得到的指纹图谱中参照峰的化学成分尚不明确，在今后的研究中可以将其进行成分分离纯化，采用液质联用技术确定其成分组成。尽管存在以上不足之处，但本研究依然为全蝎化学成分的研究、药材质量控制与评价提供了相关实验依据。