H9亚型HP株禽流感病毒繁殖规律的探索

陈慧婧 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鹅及水禽、野鸟等患病的传染性疾病，禽流感又被称为真性鸡瘟或欧洲鸡瘟[1-2]。1978年，意大利首次报道了该病的出现[3]，直到1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒的核蛋白，该病是由A型流感病毒引起[4]。感染禽流感病毒后，感染动物临床症状表现为：从无症状低致病力禽流感到中等致病力呼吸道症状，直至高致病性禽流感引起的烈性死亡[5-7]。因此，被国际兽医局列为A类传染病。

禽流感成为危害养殖业的首要疫病，并引起世界范围的高度重视。据调查发现在我国大部分禽群中流行的禽流感毒株主要是H9和H5亚型[8-9]。由于H9亚型属于低致病率、低致死率的禽流感病毒，因此，养殖户不够重视，但该病毒可一直存在于禽群中，引起轻微呼吸道症状，产蛋率下降，肉质下降，H9亚型病毒的暴发依然给养禽业带来不可估计的经济损失[10-11]。疫苗免疫是预防禽流感的重要措施和有效途径。为防止高致病性禽流感再次发生，我国采取了对家禽广泛接种灭活疫苗等措施，收到了很好的效果[12-14]。由于生产中利用SPF鸡胚培养病毒的成本高，而非免鸡胚的培养也能获取较纯的病毒，同时价格较低，故本研究用H9亚型HP株接种非免鸡胚，并对不同死亡时间段的尿囊液效价进行测定，以期探索该毒株在非免鸡胚中的繁殖规律，得出鸡胚的最佳培养时间和尿囊液收获时间，最大限度提高单位体积尿囊液中的病毒含量，为制备高效疫苗提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 禽流感病毒（H9亚型HP株）种毒代次F2，批号DZ20140306，由福州大北农生物技术有限公司提供。

1.1.2 试验动物 非免鸡胚，由扬州康威提供，福州大北农生物技术有限公司进行孵化至10日龄。SPF鸡胚，山东济南斯帕法斯SPF鸡场提供，由福州大北农生物技术有限公司进行孵化至10日龄。

1.1.3 主要试剂 生理盐水、1万IU/mL青霉素链霉素溶液、1%鸡红细胞悬液，均由福州大北农生物技术有限公司配制。

1.2 试验方法

1.2.1 禽流感病毒繁殖

1.2.1.1 照蛋、画蛋 非免疫蛋置于38～39℃、湿度50%～65%的孵化器内孵化至10日龄，照蛋剔除无精蛋和死胚。在鸡胚胎一侧画出气室边缘线，在大血管上方的气室边缘画一个小圆圈，即为接种部位。

1.2.1.2 接种 取生产用禽流感种毒DZ20140306，用灭菌生理盐水稀释至10-4～10-5，并加青霉素、链霉素100～200 IU/mL。每胚尿囊腔内接种0.1 mL稀释好的种毒，共接种1 000枚非免鸡胚，接种后密封针孔。

1.2.1.3 孵育、观察与收获 鸡胚接种后，将1 000枚鸡胚气室向上置36～37℃、湿度为60%左右的温室内继续孵化，使病毒在鸡胚内增殖，期间不必翻蛋。鸡胚接种后，24 h照蛋一次，将24 h时照蛋死亡的鸡胚弃去不用。之后需要每6 h照蛋一次，死亡鸡胚随时取出置于2～8℃冷库保存，并记录各时间段死亡鸡胚数量；直至120 h，取出所有的胚，置于2～8℃冷却12～24 h后，分别收获各时间段（30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h、84 h、90 h、96 h、102 h、108 h、114 h、120 h）死亡鸡胚尿囊液。

1.2.2 病毒含量测定

1.2.2.1 稀释、接种 取9支灭菌试管，将试管依次编号为-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9，每管加生理盐水9.0 mL。从被检样品中吸取1.0 mL加入第1管，混匀后从第1管中吸取1.0 mL加入第2管，同法依次做10倍系列稀释至第9管。稀释完成后按10-9、10-8、10-7稀释滴度顺序，每个稀释滴度接种SPF鸡胚（10日龄）5个，尿囊腔接种，每胚接种0.1 mL，接种完成后用石蜡封口，并置37℃继续培养。

1.2.2.2 照蛋 SPF鸡胚培养至24 h开始照蛋，之后每6 h照蛋1次，48 h以前死亡的鸡胚弃去不计，培养至120 h。死亡鸡胚取出，记录死亡时间后置2～8℃冰箱保存。120 h后将剩余活胚取出，室温放置15～30 min后再放入2～8℃冰箱。将48～120 h死亡的鸡胚及活胚逐个收获尿囊液，进行血凝价测定。凝集价≥1：16（微量法）者判为感染，计算EID50。

2 结 果

鸡胚接种禽流感种毒后，不同时间段死亡数量见表1，不同时间段死亡的鸡胚尿囊液效价见表2。鸡胚在60 h前死亡数量不多，在60～84 h每次照蛋死亡数量都超过了接种数量的10%，死亡比较集中在60～84 h。尿囊液效价随着培养时间逐步升高，最开始24 h只有108.17EID50/mL，随后病毒大量繁殖，在54～96 h效价达109.5EID50/mL及以上，最高时达109.63EID50/mL。

3 讨 论

禽流感（H9亚型HP株）灭活疫苗的抗原生产主要原材料是鸡胚，而鸡胚又分为SPF鸡胚、非免疫鸡胚和普通鸡胚。SPF鸡胚无特定病原体，增殖病毒滴度高，但是成本较高，在灭活苗的大生产中使用SPF鸡胚不太现实。而普通鸡胚因为鸡群频繁接种疫苗，使鸡体内有较高的抗体水平，所以，普通种蛋存在的母源抗体影响病毒的繁殖，在疫苗生产中也不可取。而非免疫鸡胚的价格相对于SPF鸡胚较为低廉，而且没有接种病毒的母源抗体，对病毒繁殖影响不大，在灭活疫苗生产中使用广泛。病毒含量高低直接影响疫苗的免疫效果，掌握最佳的培养及收获时间，最大限度提高单位体积尿囊液中的病毒含量在疫苗生产中尤为重要。

本试验着重从禽流感病毒接种后鸡胚死亡时间和不同死亡时间的病毒滴度两个方面进行，发现感染后非免鸡胚死亡数量占接种鸡胚总数的80%以上。死亡鸡胚尿囊液病毒检测结果表明，禽流感H9亚型HP株接种非免鸡胚后，鸡胚死亡高峰期出现在60～84 h，该时段病毒的滴度也处于病毒繁殖的高峰期，最高达到109.63EID50/mL；直到96 h病毒仍维持较高的水平，为109.50EID50/mL，而96 h后病毒滴度开始衰减，所以，H9亚型HP株禽流感病毒最佳培养时间为96 h。

表1 不同时间段（非免）鸡胚死亡数量

表2 不同死亡时间鸡胚尿囊液病毒含量