Wnt/β-catenin信号通路抑制剂对骨肉瘤生长作用的研究进展

谢晓亮 李玉梅 朱海霞 樊天佑

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是儿童和青少年长骨干骺端常见的原发性恶性骨肿瘤，以产生骨样基质为病理特征，具有高复发率、多药耐药性、早期易肺转移等特点[1]。以往骨肉瘤患者采用患肢手术切除治疗为主，随着以甲氨蝶呤、顺铂等为基础的新辅助化学治疗(以下简称化疗)的应用，骨肉瘤患者的5年生存率提高到60%～70%，但却不能有效地降低总病死率和改善整体预后，出现转移或复发的患者5年生存率<20%[2, 3]。Wnt/β-catenin信号通路已被证实在多种肿瘤的发生和发展中起着重要的作用[4,5]。众多研究表明，Wnt信号的异常激活和β-catenin的高表达与骨肉瘤异常组织学形态及细胞的异常增殖和分化相关，最终导致骨肉瘤的发生[6～8]。同时在骨肉瘤细胞系中Wnt/β-catenin信号的多种配体、受体以及共同受体均呈高表达，而Wnt信号抑制因子WIF-1、DKKs水平却处于低表达状态，表明Wnt/β-catenin信号在骨肉瘤细胞中的异常激活是导致骨肉瘤发生和发展的一个重要因素[9]。因此，通过靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性可能成为骨肉瘤治疗的一个新策略，寻找Wnt/β-catenin信号通路抑制剂成为探索治疗骨肉瘤的新热点。

一、Wnt/β-catenin信号通路的组成及机制

Wnt信号通路在胚胎发育中扮演重要角色，对控制骨骼发育、骨量和成骨细胞分化起关键作用。Wnt信号通路由细胞膜(包括膜外和膜上)、细胞质和细胞核3部分信号组成，即细胞膜外Wnt蛋白，细胞膜上特异性7次跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled)和辅助性受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)，胞质内的散乱蛋白(Dvl)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、轴蛋白(Axin)、结直肠腺瘤性息肉蛋白(APC)、酪蛋白激酶Ⅰ(CK1)、β-连环蛋白(β-catenin)，细胞核内转录因子T细胞因子(TCF)/淋巴样增强因子(LEF)家族及其下游靶基因，如MMPs、survivin、cyclin D和c-Myc等组成，由于经典Wnt通路的启动依赖β-catenin转入细胞核，故称为Wnt/β-catenin信号[10, 11]。

在没有Wnt配体存在时，胞质内大部分β-catenin与细胞膜上E-钙黏蛋白结合，使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上介导细胞之间黏附。对于少部分游离型β-catenin则被Axin、APC、CK1和GSK-3β形成的β-catenin降解复合物通过氨基端磷酸化及U3泛素连接酶β-转导素重复蛋白(β-TRCP)识别泛素化，最终通过泛素蛋白酶体途径降解。因此细胞内游离的β-catenin水平低，不能转入细胞核内启动转录因子TCF/LEF的转录作用而阻止下游靶基因的表达[12]。反之，当细胞受到Wnt信号刺激时，胞膜外配体Wnt蛋白分子同时与7次跨膜细胞的特异性受体Frezded和辅助性受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)结合，促进胞质内Dvl蛋白的活化，活化的Dvl蛋白抑制β-catenin降解复合物中关键成分GSK-3β的活性，使β-catenin不被GSK-3β磷酸化，避免了泛素蛋白酶体对其识别和降解而积聚在细胞质中。当β-catenin在细胞质中积聚到一定浓度时就开始转向细胞核内，并与细胞核内转录因子TCF/LEF结合导致下游靶基因的启动因子暴露而被激活表达，引起细胞的异常增殖，凋亡抵抗等作用，促进肿瘤的形成[9]。因此，β-catenin被认为是整条信号通路中的关键枢纽分子，它由细胞质向细胞核的转移被认为是该信号通路激活后行使其功能的重要特征[13]。

二、Wnt/β-catenin信号通路抑制剂与骨肉瘤

骨肉瘤是一种高度恶性的侵袭性疾病，虽然随着根治性手术结合新辅助化疗的应用，患者的5年生存率有了较大的提高，但它仍然是医学上难以攻克的难题。以往研究表明Wnt/β-catenin信号通路的异常激活参与了骨肉瘤的发生、发展，但其机制较为复杂，通过抑制该信号通路的活性可抑制骨肉瘤发生、发展[14]。目前通过抑制Wnt/β-catenin信号通路阻碍骨肉瘤的发展主要围绕在药物类抑制剂、酶类抑制剂、微小RNA等抑制作用的研究。

1.药物类抑制剂：耐药性是骨肉瘤患者治疗失败的归因之一，尤其是多药耐受性，寻找药物作用新靶点是解决骨肉瘤药物耐受的关键。尽管如此，对于骨肉瘤患者来说，药物耐受的关键机制仍然没有定论。

(1)GSK-3β药物作用靶点：GSK-3β可使β-catenin 磷酸化，磷酸化位点为β-catenin的4个N端位点，这些位点为β-catenin磷酸化的一个标志，将被蛋白酶体降解，是Wnt/β-catenin信号通路的负调控因子[15]。近年来， Liu等[16]研究发现青蒿素能够抑制骨肉瘤细胞和裸鼠移植瘤的生长，其机制是通过抑制GSK-3β中丝氨酸9(Ser9)磷酸化来激活GSK-3β降解β-catenin；同时青蒿素能下调骨肉瘤细胞中的Dvl蛋白，解除了Dvl蛋白对由GSK-3β、APC和Axin等形成的降解复合体中的关键成分GSK-3β活性的抑制，使β-catenin被GSK-3β磷酸化所降解，使Wnt/β-catenin信号转导失活抑制骨肉瘤的活性。同时也有研究表明冬凌草甲素通过增加GSK3β的活性和上调dickkopf-1(Dkk-1)表达，下调了β-catenin的表达抑制143B细胞的增殖作用，相反，Dkk-1过表达或β-catenin敲低可以增强143B细胞中冬凌草甲素对细胞的增殖抑制作用[17]。Chang等[18]研究表明重楼皂苷(PPI)具有抑制骨肉瘤的生长、侵袭转移作用，其机制与Wnt/β-catenin信号通路的失活有关，PPI能靶向降低p-GSK-3β的表达，导致活性β-catenin水平下调，使通路被抑制，而加入GSK-3β特异性抑制剂CHIR99021后，PPI诱导的骨肉瘤细胞活力抑制被消除，表明通过抑制该通路具有很好的抑瘤效果。综上研究可见多种药物可通过增加GSK-3β的活性，促进β-catenin的降解并减少其向细胞核内转移，使Wnt/β-catenin信号通路失活，抑制肿瘤的生长。靶向作用GSK3β使Wnt/β-catenin信号通路失活可能是骨肉瘤的潜在治疗靶点。

(2)β-catenin药物作用靶点：Ma等[19]体外实验研究表明夹竹桃苷能抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭，促进细胞的凋亡，具有很好的抗癌作用，其作用机制是通过减少骨肉瘤细胞质总β-catenin的表达以及减少β-catenin向细胞核内转入，抑制了Wnt/β-catenin信号通路转导。同时Wnt特异性TOP/FOP荧光酶素报告基因表达量的减少也表明减弱了转录因子TCF/LEF在Wnt/β-catenin信号通路中的转录活性，以及下调Wnt靶基因MMP2和MMP9的表达抑制细胞的迁移侵袭能力。Guo等[20]研究表明黄芩素处理的骨肉瘤细胞中β-catenin及其靶基因(包括C-myc，cyclin D1和survivin)的水平显著下降，而β-catenin的外源性过表达可逆转黄芩素的抗增殖和抗转移作用。在异种移植瘤模型，发现黄芩素的治疗显著抑制移植瘤的生长，提高荷瘤鼠的生存率，抑制瘤体β-catenin的表达。Tie等[21]研究表明淫羊藿苷通过下调Wnt/β-catenin信号通路能诱导骨肉瘤细胞的凋亡及抑制细胞的生长，减弱TOPFlash荧光表达，腺病毒过表达β-catenin后能逆转淫羊藿苷的抑制作用。Liu等[22]研究表明芹菜素可抑制人骨肉瘤细胞增殖，减少其侵袭能力，下调β-catenin的表达抑制骨肉瘤的生长。当β-catenin过表达时抑制作用减弱，敲减β-catenin的表达时抑制作用增强，表明芹菜素通过作用该通路抑制骨肉瘤细胞的生长。同时另有研究表明白藜芦醇、乌索酸等也具有通过下调β-catenin的表达抑制Wnt/β-catenin信号的活性而使骨肉瘤细胞的生长被抑制[23，24]。

以上研究表明，不同药物具有不同的作用靶点，其中β-catenin的下调对通路的活性抑制具有重要的作用，通过抑制通路的不同环节使异常激活的Wnt/β-catenin信号通路被抑制将是骨肉瘤治疗的重要策略之一。

2.酶类抑制剂:Xia等[25]研究表明环氧化酶COX-2塞来昔布通过激活GSK-3β依赖性基因的转录使β-catenin被磷酸化而降解，减少β-catenin向细胞核转入而使Wnt/β-catenin信号通路失活，抑制MG-63细胞生长。Li等[26]研究表明TIKI2是抑制Wnt信号的蛋白酶，在骨肉瘤标本和细胞系中TIKI2低表达，TIKI2蛋白酶能抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性，能将成熟的Wnt蛋白去除N-末端氨基酸，Wnt蛋白随后被寡聚化而失活。通过腺病毒转染TIKI2恢复其表达后促进β-catenin的磷酸化和减少细胞核β-catenin表达，抑制了骨肉瘤细胞的增殖。同时在荷瘤鼠实验中使用Wnt激活剂后能减弱TIKI2对瘤体的生长抑制作用，表明TIKI2对骨肉瘤的抑制作用是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用的。在活性酶的水平上进行调控是一高效的方法，环氧化酶COX-2和TIKI2蛋白酶均能抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，从而抑制骨肉瘤细胞的活性，对骨肉瘤的治疗具有很好的应用价值。

3.微小RNA：越来越多的研究表明微小RNA(miRNA)失调和Wnt/β-catenin信号通路共同推动癌症的发生、转移和耐药性。miRNA具有定向调节基因表达作用，通过对基因的修饰，一些miRNA启动子含有Wnt信号通路中细胞信号分子的特异性结合位点，能激活或抑制Wnt信号通路的各步骤。就肿瘤的发病和预后而言，miRNA可以扮演癌基因或抑癌基因的角色，而miRNA主要在转录后水平调节基因的表达且与骨肉瘤的发病机制相关，具有更优越的应用前景。Li等[27]研究表明miR-370作为肿瘤抑制因子，miR-370能够靶向抑制FOXM1与β-catenin相结合形成的复合物，抑制β-catenin从细胞质转移到细胞核，抑制转录因子TCF/LEF的转录启动，使Wnt/β-catenin信号通路失活，具有抑制肿瘤细胞生长和侵袭转移作用。同时另有研究表明，miR-182能靶向作用HOXA9的转录后修饰，下调Wnt/β-catenin信号转导，促进了人骨肉瘤细胞的凋亡。Yang等[28]研究发现miR-183具有抑癌功能，Wnt信号通路中的LRP6 mRNA 3′-UTR含有保守的miR-183结合位点，MiR-183通过直接靶向其3′-UTR来下调LRP6的表达使Wnt/β-catenin信号转导通路失活。当LRP6过表达后具有逆转miR-183对肿瘤抑制作用，表明miR-183 能使Wnt/β-catenin信号转导途径失活，抑制骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭作用。Zhang等[29]研究表明miR-107能够靶向作用于Dkk-1的 3′-UTR区域，miR-107的过表达可以促进Dkk-1的表达，而Dkk-1为竞争性结合LRP 5/6关闭了Wnt/β-catenin信号通路，抑制骨肉瘤细胞的生长。综上研究表明，miRNA通过靶向结合Wnt信号通路的不同分子，对通路相关分子进行基于水平的修饰而影响骨肉瘤细胞的生长。

4.其他:围绕以抑制Wnt/β-catenin信号通路而使骨肉细胞的生长受抑制，Yong等[30]研究发现，癌症亮氨酸拉链下调因子1(LDOC1)表达增加与Wnt5a水平降低相关，降低了骨肉瘤细胞的肺转移能力。上调骨肉瘤LDOC1表达，减少Dvl2和Wnt5a的表达，而Dvl2和Wnt5a都是Wnt信号通路蛋白并参与肿瘤侵袭和转移，从而表明LDOC1可以通过直接/间接与Wnt信号通路相互作用调节骨肉瘤的侵袭转移。Zhang等[31]研究表明，RAS蛋白家族RASSF4在骨肉瘤组织和细胞中低表达，RASSF4过表达显着抑制骨肉瘤细胞的增殖，迁移和侵袭以及EMT过程。同时，RASSF4过表达显着降低骨肉瘤细胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的蛋白表达，表明RASSF4是通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤的活性。以上研究表明，调节因子和拮抗剂在抑制Wnt/β-catenin信号通路的同时也具有抑制骨肉瘤的活性，具有很好的应用前景。

三、展 望

信号通路是当今生物医学研究领域较活跃的主题之一，经典的Wnt/β-catenin信号通路是一条研究较明确的通路，以往大量研究证明Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是导致骨肉瘤发病的机制之一，为临床骨肉瘤的治疗提供了一个潜在的治疗思路。但目前仍处于实验和探索阶段，缺乏相关的临床试验。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂能够通过调节通路信号分子而失活，抑制骨肉瘤细胞增殖，促进骨肉瘤细胞凋亡。这些实验数据证实了Wnt/β-catenin信号通路是治疗骨肉瘤很有前景的治疗策略。因此，在大量实验研究的基础上，可以进行基于Wnt/β-catenin信号通路的前期临床试验研究，进一步证明Wnt/β-catenin信号通路是治疗骨肉瘤有效的靶点，为临床上应用Wnt/β-catenin信号通路治疗骨肉瘤提供一个有力的依据。此外，当前的研究多集中在单信号通路之间的抑癌作用，不同信号通路之间的交互作用需进一步探讨。也有研究表明此通路参与人体正常生理反应，抑制该通路时是否会同时带来其他的不良反应需进一步研究[13]。不同抑制剂在体外的作用效果当在复杂的体内生理环境下是否具有同样的效果，需开展相关的动物实验及临床试验进行验证。因此，随着相关机制不断深入研究，人们可以从更多的角度进行探索骨肉瘤的治疗靶点，并获得基于该靶点治疗骨肉瘤的可能，将为人类战胜肿瘤提供新的希望。