γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的应用及进展

史培，徐凯进（通信作者）

浙江大学附属第一医院感染科 （浙江杭州 310003）

结核病（tuberculosis， TB）是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的呼吸道传染病，目前该病疫情依然严峻。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）估计，2017年全球结核病新发病例数为1 000万例，中国有88.9万例；全球有157万人死于结核病；全球23%的人口（约17亿）存在潜伏结核感染[1]。

结核分枝杆菌属胞内寄生菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫，这也是结核病诊断的困难所在。控制结核病的关键在于控制传染源，高特异度和高灵敏度的早期诊断技术及试剂对结核病的早期诊断，及时有效治疗，有效切断传染源，控制疾病流行至关重要。当前结核病的众多诊断方法或多或少存在缺陷。传统的痰涂片镜检灵敏度低，而分离培养法鉴定菌种及药敏结果所需时间较长（4～6周）[2]。病理学检查取材不易、灵敏度低且鉴别诊断困难。结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）虽简便廉价，但其使用的抗原——结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）与卡介苗（bacille Calmette-Guérin，BCG）和非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）之间存在交叉反应，特异度较低；TST依赖人体的免疫反应，对免疫受损人群灵敏度不足[3]；且TST耗时较长（48～72 h），易受操作者主观因素影响。γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)作为一种新兴免疫学诊断方法，在控制结核感染及发病等方面得到迅速推广，且随着新的生物学标志物的寻找和IGRA方法学的改进，其在临床上具有广阔的发展前景。

1 IGRA原理和方法

结核分枝杆菌中存在独有的“RD1”区域，医学界利用该基因区编码的抗原多肽作为特异性抗原，主要有早期分泌抗原靶分子6（early secreted antigenic target 6，ESAT-6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10），有些产品在此基础上增加了TB7.7抗原多肽，体外刺激机体特异性效应T淋巴细胞，通过酶联免疫吸附试验或酶联免疫斑点试验（ELISA或ELISPOT）定量检测所释放的γ-干扰素水平，进而判定是否存在MTB，这便是IGRA的原理。

目前，IGRA主要有两种商业产品：一种是以ELISA原理为基础的澳大利亚Cellestis公司生产的QFT（QuantiFERONTB）、QFT-G（QuantiFERON-TB Gold）和QFT-GIT（QuantiFERON-TB Gold In-Tube），该产品采用ELISA检测经MTB特异性抗原刺激后致T细胞所释放的γ-干扰素含量；另一种是以ELISPOT原理为基础的英国牛津Immunotech公司生产的T-SPOT.TB，该产品可分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），通过ELISPOT技术检测经MTB特异性抗原刺激后能产生γ-干扰素的T细胞数量。

IGRA使用的结核杆菌特异性抗原位于RD1区， 与卡介苗及大多数非分枝杆菌无交叉免疫反应，具有较TST更高的特异度。第一代QFT使用PPD作为特异性抗原，第二代使用ESAT-6和CFP-10，第三代则使用ESAT-6、CFP-10和TB7.7，因此其诊断特异度也不断提高。2015年底公布的第四代检测试剂QuantiFERON-TB Gold Plus（QFT-Plus）首次加入CD8+T细胞应答数据，还可评估潜伏性结核感染发展为活动性结核病的风险[4]。关于这项检测方法在结核病诊断中的应用，临床已进行了诸多研究。

2 IGRA的临床应用

2.1 筛查潜伏性结核感染

潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）定义为细菌活性持续存在，受到免疫控制，且没有活动性结核病临床证据的状态，但不能将其彻底清除。潜伏性感染者如不进行治疗，5%～10%会发展成活动性结核，在免疫抑制等高危人群中，这一比例更高[5]。从结核病低发病率国家（1＜1 000人年）过去10年间对不同高危人群潜伏性结核感染发生率和活动性结核病发病率的调查来看[6]，矽肺患者潜伏性结核感染发生率较高，QFT-GIT、T-SPOT.TB的阳性率分别为46.6%和61.0%，随访10年期间其活动性结核病发病率最高，中位发病率为32.1/1 000人年；血透患者活动性结核发病率紧随其后，中位发病率为26.6/1 000人年，QFT-GIT、T-SPOT.TB、TST 3种方法检测出的潜伏感染率分别为33.4%、43.6%、21.9%；HIV感染者活动性结核发病率也较高，中位发病率为16.2/1 000人年，QFT-GIT、T-SPOT.TB、TST的阳性率较低，分别为14.5%、11.3%、19.2%，考虑感染率较低与该人群免疫水平有关。

我国是全球结核潜伏感染负担最重的国家之一[7]，筛查LTBI具有重要意义。Gao等[8]对我国农村大规模人口同时使用IGRA （QFT-GIT）和TST进行结核分枝杆菌感染率调查，结果显示，＞5岁人群中的LTBI在13%～20%，均数为18%；TST与QFT-GIT的结果差异大，考虑与我国BCG普遍接种这一背景有关，故以TST结果为基准的流行病学调查可能高估了我国结核潜伏感染率。该研究还发现基于中国农村QFT转变后持续阳性结果年结核感染率为1.5%，老年人是新发感染的高风险人群，且感染具有持续性。

由此可见，IGRA对诊断LTBI和预测发展为活动性结核的价值更好。WHO强烈推荐IGRA应当在部分资源条件许可的高收入和中高收入国家用于检测LTBI，而在中低收入国家和结核病高负担国家，IGRA不应取代TST 检查[9]。

2.2 辅助诊断活动性结核病

2.2.1 准确性评价

结核病例的发现和及时治疗是结核病控制的基石。基于不同的流行病学背景（低或高负担国家）、年龄或免疫状态，多篇文献评估了IGRA在活动性结核尤其在菌阴结核病中的诊断价值，报道的IGRA总体灵敏度和总体特异度分别为80%和79%，高于TST（总体灵敏度和总体特异度分别为65%和75%）[10-11]。为比较T-SPOT.TB和QFT-GIT在结核感染方面的诊断价值，邵凌云等[12]选取41例活动性结核患者和201例非结核患者，结果显示T-SPOT.TB和QFT-GIT诊断活动性结核的灵敏度分别为85.4%和70.0%，特异度分别为72.1%和77.0%，提示两者对活动性结核的诊断效力相似。尽管IGRA无法确诊或排除活动性结核，但其在缺少细菌学依据的结核病诊断中具有一定的辅助价值。

2.2.2 辅助诊断肺外结核

肺外结核(extrapulmonary tuberculosis ，EPTB)因含菌量少、取材困难常无法获得病原学或病理确诊，IGRA在肺外结核的诊断中具有较高灵敏度。由于抗原特异性效应T细胞趋于MTB感染的局部聚集，IGRA技术也可用于检测支气管肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液等非外周血标本，从而诊断肺内及肺外结核。Liu等[13]对168例胸腔积液患者进行了前瞻性研究，采用T-SPOT.TB同时检测其胸腔积液和外周血标本。结果显示胸腔积液T-SPOT特异度明显高于外周血T-SPOT.TB（P=0.002）。Aggarwal等[14]Meta分析了20个（1 085例）检测全血和14个（727例）检测胸腔积液的研究结果，全血检测和胸腔积液检测的灵敏度和特异度分别为77%和71%、72%和78%，进而得出IGRA对结核性胸膜炎的诊断价值有限的结论。以上提示，文献报道的检测胸腔积液γ-干扰素的灵敏度和特异度差异较大；因目前IGRA试剂盒的检测流程及界限值并不完全适用于非血液标本，其应用于浆膜腔积液的诊断效能有待进一步研究。

2.2.3 在特殊人群中的诊断价值

由于IGRA试验依赖于人体的免疫反应，应特别注意在免疫缺陷患者中的应用，包括HIV感染、免疫相关疾病、恶性肿瘤、移植患者等。来自高、低负担国家的荟萃分析数据显示[15]，QFT-GIT检测HIV/TB双重感染的灵敏度和特异度分别为69%和76%，T-SPOT.TB检测的灵敏度和特异度分别为89%和87%。提示：与QFT-GIT相比，T-SPOT.TB辨别HIV感染者中的活动性结核病例更为准确。分析原因，考虑T-SPOT.TB方法不受患者外周血淋巴细胞数差异的影响，更能客观、准确地反映机体对MTB的特异性免疫功能。有研究发现QFT和TSPOT.TB的不确定结果在HIV感染者中分别为8.2%和5.9%，这一比例在结核高负担国家以及CD4+T细胞＜200个时更高[16]。IGRA不确定结果概率的增加缘于免疫抑制状态影响T淋巴细胞功能，从而引起阳性对照管的γ-干扰素分泌不足。IGRA并非HIV阳性患者活动性结核确诊的最佳方法，目前使用的IGRA不能代替细菌学方法或核酸扩增技术(nucleic acid amplification techniques，NAAT)。

儿童感染MTB后发生活动性结核的风险高于成人，因儿童细菌载量低、咳嗽反射差等特点，导致病原学检查阳性率很低。国内外IGRA检测儿童结核病的荟萃分析显示其灵敏度和特异度差别较大，多数研究结果显示，IGRA的灵敏度与TST相当，而特异度优于TST。Laurenti等[17]纳入15篇文献评估了IGRA在免疫功能正常儿童中检测细菌学证实的活动性结核病的灵敏度和特异度，结果显示，TST、QFTGIT和T-SPOT.TB的灵敏度分别为88.2%、89.6%和88.5%，无显著差异；但QFT-GIT和T-SPOT.TB比TST具有更高的特异度（分别为95.4%、96.8%和86.3%）。该结论提示两种IGRA可用于检测免疫功能正常儿童的活动性结核病例。有研究显示＜5岁或HIV感染儿童的TST及IGRA检测灵敏度较低[18]。因此，应用IGRA对儿童活动性结核病进行辅助诊断时要充分考虑年龄及免疫状态的影响。

2.2.4 鉴别其他疾病

在鉴别诊断中，痰涂片阳性而IGRA阴性者需要排除非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacterium，NTM）感染。但需注意的是，在极少数非结核分枝杆菌——堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、戈登分枝杆菌等也存在与IGRA所用相同的抗原，故IGRA不能区分MTB感染还是以上几种NTM感染。在孤立性肺结节或肿块中结核瘤与肿瘤的鉴别仍是一大诊断难题。Wang等[19]对CT、病理和（或）病原学确诊的331例患者同时进行TST、IGRA检测，提示直接利用T-SPOT.TB结果不能很好地区分结核瘤和肿瘤，进一步计算了TB-specific antigen（TBAg）与T-SPOT.TB的植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）的比值，阈值取0.236时TBAg/PHA比值在鉴别孤立性肺结节或肿块是否为结核瘤或肿瘤的灵敏度和特异度分别为80.6%和93.3%，受试者工作特性曲线（ROC）曲线下面积（AUC）为0.921，表明TBAg/PHA比值可改善对这两种疾病的鉴别。TBAg/PHA比值还可用于区分结核瘤与其他良性疾病（AUC 0.909，灵敏度85.07%，特异度90%）。

2.3 预测活动性结核病

阳性的IGRA结果与随访期间发展为活动性结核密切相关。阮巧玲等[20]比较了T-SPOT.TB和TST在我国活动性肺结核病患者的家庭接触者中预测活动性结核病的能力，对157名家庭接触者随访6年，计算发病率为11.0/1 000人年，T-SPOT.TB的阳性预测值（PPV）为8.3%，阴性预测值（NPV）为96.7%；TST≥5 mm和TST≥10 mm的PPV分别为7.7%和9.5%，NPV均为95.8%。可见，家庭接触者结核发病风险高于一般人群，而T-SPOT.TB与TST对活动性结核病的预测能力相当。

一项高质量的研究来自Andrews等[21]前瞻性随访南非2 512名18～24周龄未感染HIV的幼儿，进行QFT筛查与监测结核感染和发病状况。结果显示，QFT检测结果转阳且γ-干扰素值非常高（＞4.0 IU/ml）的幼儿，其结核病的发病风险显著提高，是结果无变化幼儿的40倍和QFT转阳且γ-干扰素值在0.35～4.0 IU/ml范围内幼儿的11倍；当使用4.0 IU/mL作为判读阈值时，后续对疾病的灵敏度和特异度分别为36%和99%，对结核发病率预值可达43%。提示IGRA阳性结果较TST阳性结果更能准确地预测幼儿活动性结核的发病。

2.4 监测疗效

活动性结核病在有效的抗结核治疗后，结核杆菌载量和效应T细胞数量会随之下降，理论上IGRA反应会从阳性转变为阴性。为了探究IGRA能否用于评估治疗反应并预测活动性结核病的失败或复发，一些研究尝试将IGRA中γ-干扰素的变化与已确定的治疗反应标志物（涂片和培养转阴）联系起来[22]。在一项最大的研究中，Denkinger等[23]发现随着时间的推移γ-干扰素反应显著下降，但与涂片或培养转阴没有显著相关性。Clifford等[24]系统综述了IGRA对活动性结核病和LTBI的治疗监测数据，约一半的研究发现IGRA的定量反应在结核病治疗过程中下降，尤其是在活动性结核病中；定性分析显示，治疗结束时IGRA逆转率的研究差异很大（0%～72%），这表明测量IGRA的定性变化并不能为监测活动性或潜伏性结核病的抗结核治疗提供可靠方法。关于LTBI的治疗是否影响IGRA反应，一篇质量较高的随机试验研究给出了相同的结论，该研究将211例LTBI患者随机分为异烟肼（INH）治疗组和安慰剂组，通过T-SPOT试验分别测定0、1、3、6个月时的CFP-10和ESAT-6反应，随访期观察到反应有所下降，但两组结果无显著性差异[25]。

3 IGRA的未来方向

IGRA是诊断结核感染的免疫学方法，为进一步提高特异度和灵敏度、区分潜伏与活动性感染、预测活动性结核风险、监测抗结核治疗反应，基于IGRA的发展方向大多聚焦在以下几个方面。

3.1 细胞刺激抗原的筛选

抗原的特异性是决定γ-干扰素释放试验结果特异度的主要因素。抗原Rv2654 （TB7.7）已被纳入新一代的QFT-GIT。在ELISPOT试验中添加第三个抗原（Rv3879c），提高了T-SPOT.TB的灵敏度[26]。随着试剂的进一步改良，需要在MTB的RD1区筛选更新的目标蛋白。今已发现Rv3873、Rv3615c为进展为活动性结核的早期标志物。谭曙光[27]筛选鉴定了7条Rv3615c抗原中中国人群主要位点分子限制性细胞表位，再通过大样本临床验证试验发现，与T-SPOT.TB相比较，应用Rv3615c、ESAT-6和CFP-10抗原组成的三抗原组合肽库对结核感染的总体检出率提高了3.6%，对菌阴结核的检出率提高了6.6%。

3.2 多种细胞因子联合检测

γ-干扰素是细胞免疫介导产生的最为关键的细胞因子，其他细胞因子，如干扰素诱导蛋白10（IP-10）、白细胞介素2（IL-2）、单核细胞趋化蛋白2（MCP-2）的发掘，使少数γ-干扰素水平不升高、IGRA检测阴性的结核病患者得以早期诊断。2014年，Guo等[28]对14项IP-10诊断研究数据进行的Meta分析表明，IP-10诊断结核分枝杆菌感染的总灵敏度为73%，特异度为83%，其诊断活动性结核病的曲线下面积为0.88。提示建立在现有IGRA的基础上，IP-10可作为一种新的诊断标志物，从而提高诊断准确率。在评估这些生物标志物的诊断准确性的同时，未来的研究方向还应关注多种细胞因子联合检测可能是区分活动性和潜伏性感染及预测结核发病风险的关键。

3.3 结核感染不同时期分子标志物的研究

结核分枝杆菌特异性CD4+和CD8+T细胞亚群在不同MTB感染阶段的表型和功能的变化，可能可以区分活动性结核和潜伏性结核感染[29]。Pollock等[30]前瞻性比较活动性结核和潜伏性结核感染患者中结核分枝杆菌特异性细胞免疫情况，通过多色流式细胞仪测量CD4+和CD8+T细胞表型和γ-干扰素、IL-2和TNF-α的分泌。结果表明：活动性结核病显示γ-干扰素/TNF-α单阳或γ-干扰素与TNF-α双阳更多见，纯化蛋白衍生物特异性抗原CD4+单分泌TNF-αT细胞的效应表型能准确区分活动性结核病和潜伏结核感染，曲线下面积为0.99；因此，得出结论：T细胞表型和功能的联合检测是判断结核病活动性的一种高敏生物标志物。

某些抗原只能在结核感染的特定状态下被识别。结核抗原肝素结合血凝素（HBHA）被认为是一种潜伏期特异性抗原，与ESAT-6、CFP-10以及纯化蛋白衍生物特异性抗原CD4+T细胞结合，可以区分活动性和潜伏性结核病感染[31-32]。目前这些联合方法的诊断和监测潜力仍有待大规模前瞻性研究验证。

综上所述，IGRA方法是目前诊断LTBI的首要标准；在活动性结核病及多种肺外结核诊断中具有辅助及补充诊断作用；IGRA的诊断价值需要结合人群的年龄、免疫状态等进行分析，才能得到更为合理的应用；增加新的诊断抗原、增加γ-干扰素以外的诊断标记将是IGRA的未来研究方向，具有一定前景。