基于UPLC-PDA生物碱指标性成分含量和特征图谱的不同产区黄连（味连）整体质量表征研究＊

彭 平，解素花，彭平安，冉孟国，迟玉明，刘 希，杜 菁，张蓓，李东影，田瑞华

（1.北京同仁堂科技发展股份有限公司 北京 100079；2.重庆旺隆黄连科技有限公司 重庆 409100；3.北京中研同仁堂医药研发有限公司 北京 100079；4.北京中医药大学 北京 100029；5.中国北京同仁堂（集团）有限责任公司 北京 100079）

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch,、三角叶黄连Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云连Coptis teetaWall.的干燥根茎。以上3 种分别习称“味连”、“雅连、“云连”[1]。由于黄连生产量与市场需求量关系，目前中药材市场中黄连的主要流通品种以“味连”为主。2015 版《中华人民共和国药典》黄连项下，采用盐酸-甲醇提取液，磷酸盐缓冲流动相分析方法对“味连”进行质量控制，以盐酸小檗碱对照品峰面积为对照，分别计算表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀的含量。研究发现，黄连中除了以生物碱为主的活性成分之外，还含有多种其他类成分，如酚类、木质素类，黄连降血糖、抗菌等药效为各类成分的协同作用[2-5]。因此，同时分析研究黄连中生物碱以及非生物碱成分，有助于更为全面的对黄连质量进行评价。现已有文献报道采用HPLC 指纹图、UPLC-MA/MS 指纹图谱等方法对黄连药材进行了较为全面的质量研究[6-11]，但未从黄连药材生物碱和非生物碱类成分同时整体评价黄连药材质量。基于此，本研究采用UPLCPDA 液相色谱法，首次建立了可同时分析测定黄连中生物碱和非生物碱类成分的特征图谱分析方法，对31批次不同来源黄连药材进行整体质量分析，对比分析了四川、石柱、湖北等“味连”主产区黄连药材质量差异，为黄连药材的质量评价提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

Waters UPLC HCLASS-2998PDA detector（沃特世科技（上海）有限公司）；纯水仪；KQ-250DE型数控超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；MettlerML204 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利集团）；MettlerXP205型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利集团），0.22 μm 微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 样品信息

黄连样品分2 次收集了重庆产区15 批次黄连药材，一次收集了湖北产区5批次药材，一次收集了四川产区11 批次黄连药材样品，均为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch，味连（表1）。

1.3 对照品

表小檗碱对照品（含量98%，批号B20108；购自上海源叶生物有限公司），盐酸黄连碱（含量95.1%，批号：112026-201601）、盐酸巴马汀（含量86.8%，批号：110732-201611）、盐酸小檗碱（含量86.8%，批号：1107113-201613）均购自中国食品药品检定研究院。

1.4 对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含盐酸小檗碱75 μg、盐酸黄连碱30 μg、表小檗碱15 μg、盐酸巴马汀30 μg的混合溶液，即得。

1.5 供试品溶液的制备

取本品粉碎，过四号筛，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性

色谱柱：Waters CORTECS Shield RP18 Column（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；以乙腈为流动相A、0.3%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0-3 min，2-13 % A；3-15 min，13-15%A；15-20min,15%A;20-22min,15-2%A）流速0.4 mL•min-1，柱温35 ℃，检测波长为210 nm，进样体积1 μL，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于6 000。色谱图见图1。

表1 黄连药材样品来源信息

2.2 色谱峰化学成分类型归属

根据色谱峰DAD 光谱图，结合对照品标定，对黄连征图谱中18个主要特征峰进行化学成分类型归属，指认了其中4 个生物碱类成分色谱峰。其中6、9、10为酚类成分，11-18号色谱峰为生物碱类成分，其余为其他类成分

2.3 线性关系考察

图1 黄连（味连）特征图谱

表2 黄连特征图谱色谱峰信息

精密称定盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀对照品，配制成浓度分别为148.116 μg•mL-1、34.616 μg•mL-1、22.280 μg•mL-1、16.443 μg•mL-1的混标溶液，精密吸取混标溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 μL 分别平行进样两针，计算平均峰面积。以进样量X（μg）为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。建立色谱峰面积对进样量的回归方程（表3），结果表明，各成分在检测的浓度范围内线性关系良好。

2.4 精密度考察

取同一样品溶液，连续进样6次，进样量均为1 μL，记录峰面积值，计算RSD 值，结果盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的RSD 分别为0.7%，0.8%，0.5%，0.8%，其他各色谱峰峰面积和相对保留时间精密度均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性考察

取样品6份，分别按样品处理方法制备样品溶液，并进样测定，记录峰面积，计算各指标性成分含量。结果盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀平均含量分别为17.32，9.63，56.95，9.27 mg•g-1；RSD分别为1.4%，1.4%，1.0%，1.1%；其他色谱峰峰面积和相对保留时间重复性RSD 值均小于3%。表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性考察

取同一样品溶液，分别于0，3，6，9，12，24 h 进样测定，进样量均为1 μL。结果盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的RSD分别为1.3%，1.5%，1.1%，1.3%，其他各色谱峰峰面积和相对保留时间精密度均小于3%，表明样品溶液在24 h 内基本稳定。

2.7 加样回收率考察

取已知4 个生物碱指标性成分含量的黄连粉末6份，每份50 mg，每份分别加入用甲醇配制的混合对照品溶液50 mL（盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀浓度分别为17.064 μg•mL-1，8.912 μg•mL-1，55.648 μg•mL-1，8.466 μg•mL-1），称定重量，超 声（250 w，50 kHz）使溶解，放冷，用甲醇配制的混合对照品溶液补足重量，过滤，取续滤液，进样1 μL测定。根据测得的各成分的量，计算各成分的加样回收率和RSD（表4）。

表3 4种生物碱类成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.8 多批次黄连样品指标性成分含量测定结果

取31 批次黄连粉末各0.1 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，进样1 μL，测定峰面积，按照外标一点法计算各成分含量（表5）。

2.9 多批次黄连样品特征图谱质量表征结果

取31 批次黄连粉末各0.1 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，进样1 μL，记录黄连样品特征图谱及特征图谱峰面积值。对比31 批次特征图谱发现，31 批次不同产地黄连药材特征图谱特征峰数量无明显差异，均检测到18 个特征色谱峰，但特征峰峰面积值差异较大，1 号、2 号、4 号、5 号未知类成分色谱峰峰面积值可直观看出较明显差异（图2）。

以盐酸小檗碱为对照，分别计算黄连特征图谱中11、12、13、14 号色谱峰对应生物碱类成分含量，并计算生物碱成分总含量（表6）；以色谱峰面积值/称样量，计算黄连特征图谱中1-10号非生物碱类成分含量表征值（表7）；以盐酸小檗碱色谱峰为参比，计算18个特征峰相对峰面积比值（表8）。

2.10 不同批次黄连药材整体质量表征差异分析

结合表6、表7中黄连药材生物碱类成分含量和非生物碱类成分相对含量，对31批次黄连药材按质量差异分3 次排列分类：①以生物碱类成分总含量为指标由低到高排列，取低于总样本中位值的黄连药材批次归为第3 级；②余下批次以酚类成分相对含量总和为指标由低到高排列，取值低于总样本中位值的黄连药材批次归为第2 级；③余下批次以其他类成分相对含量总和为指标由低到高排列，取值高于总样本中位值归为第1 级，余下批次归为第2 级；排列结果见表9。关联黄连药材样品产区来源可知，第1 级主要来源于四川和重庆1 产区；第2 级主要来源于四川产区和部分重庆1 产区、湖北产区；第3 级主要来源于重庆2 产区、湖北产区和部分重庆1产区。

表5 31批次黄连样品含量测定结果（n=2）

图2 编号s8、s6、s5、s22、s25、s26号黄连药材特征图谱对比图

表6 以盐酸小檗碱为对照的31批次黄连药材生物碱含量表征（mg·g-1）

2.11 不同产区黄连药材整体质量表征差异分析

（1）不同产区黄连药材生物碱类成分含量表征差异分析

根据表6结果，分别对应黄连药材产地信息，以31批次黄连药材中各生物碱成分含量中位值为标准，统计各产区高于中位值的黄连药材样本量，由表10 可知，31 批次黄连药材总样本量中，重庆1 产区样品11号色谱峰生物碱成分含量高于中位值的黄连药材批次占比明显较其他产区多；四川产区样品12-18 号色谱峰生物碱成分含量和生物碱成分总含量高于中位值的黄连药材批次占比较多，其次为重庆1产区；四川和重庆1产区黄连药材生物碱类成分含量较高。

（2）不同产区黄连药材非生物碱类成分含量表征差异分析

根据表7结果，分别对应黄连药材产地信息，以31批次黄连药材中各非生物碱类成分含量中位值为标准，统计各产区高于中位值的黄连药材样本量，由表11 可知，31 批次总样本量中，四川产区样品1、5 号色谱峰表征值高于中位值的黄连药材批次占比明显较其他产区多；四川和重庆1 产区样品2、4、7、9、10 号色谱峰表征值，酚类成分含量表征总和，其他成分含量表征总和，高于中位值的黄连药材批次占比均较多；4个产区样品3、6、8号色谱峰表征值高于中位值的黄连药材批次占比相近；四川和重庆1 产区黄连药材非生物碱类成分含量表征较高，重庆1 产区酚类成分含量略高于四川产区，四川产区其他类成分含量略高于重庆1产区。

表7 31批次黄连药材非生物碱类成分含量质量表征值（AU·mg-1）

（3）不同产区黄连药材整体质量表征差异分析

以31批黄连药材特征图谱相对峰面积值为数据，采用SIMCA-P12.0 统计软件PLS-DA 模型，以黄连药材不同产区为分类，经统计分析得到PLS-DA 得分散点图和载荷散点图、变量重要性因子分布图（表7，图3，图4，图5）。

从得分图中可以看出样品的聚集以及离散程度，即样品分布点越聚集，这些样品中所含有的成分含量比值越接近，反之样品点较分散时，则说明成分含量比值差异越大。图中可见4 个产区黄连药材有所交叉。其中四川产区黄连药材质量相对较为集中区别于其他产区主要集中在第三、四象限，部分分散与第一象限与重庆1 产区交叉；重庆1 产区分为两部分，一部分分布于第一象限与四川产区交叉，一部分分布于第二象限与重庆2 和湖北产区交叉；重庆2 产区和湖北产区都聚集于第二象限，相互交叉（图3）。

表8 以盐酸小檗碱为参比的31批次黄连药材特征图谱特征峰相对峰面积值

在载荷图中，每一个点代表一个成分相对峰面积值，距离原点（0，0）较远的点，决定样品区分中的作用越大；由图4结合图5变量重要性投影（VIP）值，VIP值大于1 的色谱峰有9 个。第一象限主成分有9 号色谱峰；第二象限主成分有11、6、8 号色谱峰；第三象限主成分有1 号色谱峰；第四象限主成分有13、2、5、12 号色谱峰（图4）。

综上分析可知，重庆1 产区和四川产区部分黄连药材以第一象限主成分9号色谱峰相对含量为主要相关成分；湖北、重庆2、重庆1产区黄连药材以第二象限主成分11、6、8号色谱峰相对含量为主要相关成分；四川产区黄连药材以第三、四象限主成分1、13、2、5、12号色谱峰相对含量为主要相关成分。

（4）不同批次黄连药材质量分类关联不同产区黄连药材整体质量表征差异分析

关联不同批次黄连质量分类结果和不同产区黄连药材质量PLS-DA 分析结果，如图6 所示，第一级黄连药材主要聚集于第一象限，主成分为9（酚类）号色谱峰；第二级黄连药材主要聚集于第三、四象限，主成分为1（未知）、13（黄连碱）、2（酚类）、5（其他）、12（生物碱）色谱峰；第三级黄连药材主要聚集于第二象限，主成分为11（生物碱）、6（酚类）、8（未知）号色谱峰。

表9 31批黄连药材分类结果

表10 不同产区黄连药材生物碱类含量差异分析

3 讨论

综上分析可知，不同产区黄连药材质量表征为，四川产区黄连药材生物类成分、其他类成分高含量占比较多，重庆1 产区黄连药材酚类成分高含量占比较多，其中四川产区样品具有明显1、5 号色谱峰成分高含量特征，重庆1 产区样品具有明显11 号色谱峰成分高含量特征；以生物碱类成分含量和非生物碱类成分相对含量同时考量，可将黄连药材分为3类：第一级黄连药材主要来源于四川、重庆产区，以盐酸小檗碱为参比的9（酚类）号色谱峰成分相对含量为主要相关成分；第二级黄连药材主要来源于四川、重庆产区，以盐酸小檗碱为参比的1（未知）、13（黄连碱）、2（酚类）、5（其他）、12（生物碱）号色谱峰成分相对含量为主要相关成分；第三级黄连药材主要来源于湖北、重庆、四川产区，以盐酸小檗碱为参比的11（生物碱）、6（酚类）、8（未知）号色谱峰成分相对含量为主要相关成分。

表11 不同产区黄连药材非生物碱类成分相对含量表征差异分析

图3 不同产区黄连药材质量PLS-DA分析得分分布图

黄连药材以生物碱类成分为主要有效物质基础，生物碱类成分含量可达10%以上，其中以小檗碱含量为主，但研究发现黄连药材药效作用与其不同生物碱类成分含量比例相关，与生物碱和非生物碱类成分比例相关，因此，黄连药材质量评价不能单以小檗碱成分含量高低作为单一指标[3,5,11]，根据黄连药材整体质量相对含量差异，将黄连药材分为3 类，包括了黄连“味连”药材3 大主要产区黄连药材的质量类型，后续可针对对不同质量表征类型黄连药材开展药效表征研究，加以评价黄连药材质量。

图6 不同批次黄连药材质量分类结合不同产区黄连药材质量PLS-DA分析得分分布图

本文建立了UPLC-PDA 测定黄连药材生物碱和非生物碱类成分特征图谱，已成功用于多批次不同产区黄连药材质量差异分析，该方法简捷、稳定、准确，可在20分钟内完成黄连药材整体质量分析，可为黄连药材质量评价提供方法。