中国野生蓝莓对非酒精性脂肪肝的保肝效果

丁欢欢，景志行，许剑锋,*，刘海泉，赵 勇,3

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）

蓝莓也称越橘，是多年生常绿灌木，属于杜鹃花科越橘属，是第3代水果的典型代表之一[1]，蓝莓果实中除含有常见的糖、酸和VC外，还富含VE、VA、VB、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、蛋白质、花青苷、食用纤维以及丰富的K、Fe[2]。随着人们收入的提升和保健意识的增强，蓝莓作为一种重要保健水果，受到广大消费者的喜爱。因为野生蓝莓生长在自然环境中，相对于人工种植的品种口感较差，目前对于中国野生蓝莓的报道和研究很少，主要集中在对野生蓝莓的栽培方面，鲜有对中国野生蓝莓的系统性研究[3-4]。然而，中国野生蓝莓的花青素和维生素等营养物质的含量很高，花青素含量高达3.3～33.8 mg/kg，约是人工栽培品种的5～20 倍[5]。目前对蓝莓花青素活性的研究很多。研究表明，蓝莓花青素对黑色素瘤细胞和口腔癌细胞有较强的抑制作用[6-7]。另外，蓝莓花青素还具有抗氧化作用，其抗氧化活性比VE高50 倍，比VC高200 倍，且对人体的生物有效性是100%[8-10]。此外，蓝莓花青素还具有保肝、保护视力等作用[11-16]。

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指无酗酒经历而出现肝细胞脂肪变性的肝脏疾病[17]，是临床常见的疾病，主要是由肝细胞内脂肪堆积引起的[18-19]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和因此而导致的肝硬化[20-21]。病理性的氧化应激导致肝细胞受损，进一步诱发肝细胞过度凋亡是NAFLD产生和发展的关键因素[22-23]。

近年来，NAFLD发病率持续增长，成为最常见的肝脏疾病之一，在正常人群中发病率为20%～30%，而在肥胖人群或糖尿病患者中其发病率可高达70%～90%[24]，已经成为危害人类健康的三大肝病之一[25]。

本实验在中国野生蓝莓总花青素高效提取的基础上[26]，以小鼠非酒精性脂肪肝模型体系为研究对象，通过检测小鼠肝功能、肝脏病理损伤程度和氧化/抗氧化系统水平，评价蓝莓匀浆和蓝莓总花青素的保肝效果，为中国野生蓝莓作为功能性食品和药品的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

昆明小鼠160 只，雌雄各半，体质量为18～22 g，6 周龄，SPF级，均购自上海斯莱克实验动物有限公司（许可证号：SCXK（沪）2012-0002）。

1.2 仪器与设备

B-220恒温水浴锅 河南郑州南北仪器有限公司；202-2AB型电热恒温干燥箱 济南海波实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中国野生蓝莓中总花青素的提取

将蓝莓打成匀浆后冷冻干燥成粉末状，取150 g粉末与1.8 L甲醇-水-甲酸（体积比85∶15∶0.5）溶液混匀，漩涡振荡30 s后超声5 min，使样品重新混匀且加速提取。静置5 min后，再次漩涡振荡30 s，静置5 min，6 000 r/min离心10 min，收集上清液。残渣中加入1.8 L甲醇-水-甲酸（体积比85∶15∶0.5）溶液继续提取，重复3～5 次，直至残渣颜色不再变化，将所得上清液混合，4 ℃、8 000 r/min恒温冷冻离心5 min除去残渣，真空蒸发去除甲醇。

1.3.2 中国野生蓝莓总花青素的纯化

将1.3.1节中所得提取液经XAD-7HP大孔树脂柱纯化，体积比为1∶3。其中大孔树脂柱采用湿法装柱，取95%（体积分数，下同）乙醇洗脱3 个柱体积后，用蒸馏水洗至无醇味。取3 倍体积0.5%甲酸溶液洗脱柱子，上样，充分吸附后用0.5%甲酸酸化的醇洗脱，回收得到总花青素，去除酸化甲醇，用乙酸乙酯充分萃取3 次，最后将水层进行真空蒸发除去有机溶剂，收集得到总花青素，冷冻干燥得到冻干粉，并置于－20 ℃保存。

1.3.3 动物模型的建立与干预实验分组

在实验室进行一周适应性饲喂后，将160 只小鼠随机分为空白对照组、脂肪肝模型组、不同剂量蓝莓匀浆组、总花青素组，每组20 只。除空白对照组外，其余各组小鼠用TP23400 60%小鼠用高脂肥胖模型饲料规律性饲养3 周。高脂饲料可导致小鼠体内高脂血症以及肝脏脂代谢紊乱，使肝内TG堆积，引起肝细胞脂肪变性，肝脏结构和功能受损。高脂模型建立完成后再进行干预治疗，治疗介入6 周。实验设蓝莓匀浆低（10 g/（kggd））、中（20 g/（kggd））、高（40 g/（kggd））剂量组（以体质量计，下同）及蓝莓总花青素低（0.006 g/（kggd））、中（0.012 g/（kggd））、高（0.024 g/（kggd））剂量组；空白对照组将前期未经高脂饲料饲养的小鼠灌胃同体积生理盐水（20 g/（kggd））；脂肪肝模型组将前期经高脂饲料饲养的小鼠灌胃同体积生理盐水（20 g/（kggd））。每日灌胃1 次，共6 周，灌胃期间自由取食和饮水。

另外，过去数月，股价下跌使A股市场的高质押风险浮出水面。今年榜单的前百位富豪中，有五位富豪控股上市公司股份已被质押过半，其中排名第74位的卢志强所持有的泛海控股股票已全部质押。

1.3.4 实验样本收集及处理

实验结束前12 h，各组小鼠禁食但不禁水，心脏取血l mL左右，置于EP管中静置15 min，然后4 ℃、3 500 r/min离心10 min，分离血清，－80 ℃保存备用。小鼠处死后解剖分离肝脏，随机选取并于10%中性甲醛溶液中保存备用，将其余肝组织冷冻后置于EP管中，－80 ℃保存，用于其余各项生化指标检测。

1.3.5 肝组织的病理切片观察

将解剖取得的小鼠肝组织用10%中性甲醛溶液进行固定，石蜡包埋，稳定后进行切片，厚度5 μm，随机间隔10 张取一切片，苏木精-伊红染色之后在显微镜下进行肝组织病理形态的观察[27]。

1.3.6 血清生化指标的检测

1.3.6.1 血清转氨酶活力的测定

AST和ALT活力是临床用于诊断反映肝细胞损伤的两个最敏感的指标[28]。其中ALT活力异常升高表明肝细胞损伤，AST活力异常升高则表示线粒体损伤，两种指标能够联合反映肝细胞受损程度。AST活力的检测采用AEROSET全自动生化分析仪。ALT活力的测定采用赖氏法。其原理是ALT在37 ℃、pH 7.4的条件下和α-酮戊二酸、丙氨酸相互结合，最终生成谷氨酸以及丙酮酸，0.5 h后加入脱氧核糖核蛋白盐酸溶液进行终止，继而使2,4-二硝基苯肼与丙酮酸结构上的羰基相结合，生成红棕色的丙酮酸苯腙，后者在505 nm波长处有最强吸光度，由此计算ALT活力。测定步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3.6.2 血清脂质代谢水平的测定

血清脂质代谢水平的测定包括TC、TG、HDL-C浓度和LDL-C浓度4 个生物活性指标[29]。其中，采用酶比色法测定TC、TG浓度，通过磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C与LDL-C浓度，测定步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3.6.3 肝组织匀浆液中氧化损伤指标的测定

以4 ℃生理盐水作为匀浆介质，对肝脏组织以质量比1∶9进行匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液，4 ℃稳定保存，严格按照试剂盒说明书及文献[30]检测小鼠肝匀浆样本的T-AOC、GSH含量和MDA含量。

1.4 数据统计分析

使用SPSS 15.0软件进行统计分析，并对各组数据的组间差异性进行比较，将3 个不同剂量实验组分别与对照组进行独立样本的t检验，P＜0.05表示差异显著。所测数据均以fs表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝组织病理学变化结果

图1 小鼠肝组织病理学变化Fig.1 Pathological changes of liver tissues from mice

由图1可知，和空白对照组（图1A）相比，脂肪肝模型组（图1B）中可见肝脏脂肪变性情况严重，细胞内出现大量小型的脂肪空泡，情况较为严重者融合成较大的脂肪空泡，并将质核挤向一边；随着蓝莓匀浆剂量的增大，小鼠肝脏脂肪变性程度也随之降低（图1C～E）；和蓝莓匀浆相比，蓝莓花青素的保肝效果更为明显（图1F～H），可以观察到蓝莓总花青素中、高剂量组小鼠肝脏脂肪变性程度明显减轻。

2.2 小鼠血清转氨酶活力分析

图2 小鼠血清转氨酶的活力Fig.2 Effect of blueberry on serum transaminase activity in mice

由图2可知，与空白对照组相比，高脂饲料使AST和ALT活力显著上升（P＜0.05）；与脂肪肝模型组相比，蓝莓匀浆中剂量组对AST和ALT的活力有显著的抑制作用（P＜0.05），而与其相比，低、高剂量的蓝莓匀浆反而提高了两种转氨酶的活力；与脂肪肝模型组相比，中、高剂量蓝莓总花青素均显著降低了AST和ALT的活力（P＜0.05），且效果较蓝莓匀浆中剂量组更好。

2.3 调节脂质代谢紊乱作用分析

图3 小鼠血浆脂质水平Fig.3 Effect of blueberry on plasma lipid levels in mice

由图3可知，与空白对照组相比，脂肪肝模型组小鼠出现了比较严重的脂质代谢紊乱情况，TC、TG和LDL-C浓度显著高于正常值（P＜0.05），HDL-C浓度显著低于正常值（P＜0.05）。经过6 周的治疗介入，与脂肪肝模型组相比，蓝莓匀浆和蓝莓总花青素各剂量组TC、TG浓度显著下降（P＜0.05），但均不能使HDL-C浓度有效提高（P＞0.05）；蓝莓总花青素中、高剂量组降低LDL-C浓度作用最明显（P＜0.05）。

2.4 对肝组织氧化损伤修复作用分析

图4 蓝莓对小鼠肝组织氧化损伤的保护作用Fig.4 Protective effect of blueberry on oxidative liver injury in mice

由图4可知，与空白对照组相比，脂肪肝模型组小鼠肝组织的T-AOC和GSH含量显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.05）；和脂肪肝模型组相比，经过6 周的治疗介入，蓝莓匀浆中、高剂量组和蓝莓总花青素中、高剂量组小鼠肝组织T-AOC和GSH含量均明显升高，MDA含量明显降低，其中蓝莓总花青素高剂量组基本达到了空白对照组水平；蓝莓匀浆低剂量组和蓝莓总花青素低剂量组小鼠3 种氧化损伤指标的改变均较小。

3 结 论

目前使用最多的蓝莓花青素的提取方式是添加HCl溶液到低沸点的醇溶液中，但有研究证明HCl溶液的加入可能会引起总花青素的分解。本实验借鉴Prior等[26]的方法，采用甲醇替代乙醇进行提取，取得了较好的效果，并且添加甲酸代替HCl溶液进行提取也不易导致花青素的分解。

本研究显示，中国野生蓝莓匀浆在20 g/（kggd）的剂量下，对非酒精性脂肪肝小鼠体现出很好的保肝效果，降低了小鼠血清转氨酶的活力，对脂质代谢也有一定的调控效果，在小鼠肝组织氧化损伤各项指标上也能够有效减轻高脂饲料带来的损伤。但同时，10 g/（kggd）的蓝莓匀浆并没有显著的保肝效果，40 g/（kggd）的蓝莓匀浆剂量反而没有比20 g/（kggd）起到更好的保肝效果。

中国野生蓝莓总花青素0.012、0.024 g/（kggd）剂量组在小鼠各项指标中均显示出很好的保肝效果，但0.006 g/（kggd）蓝莓总花青素组各指标和病理学切片都没有显示出很好的保肝作用，即不具有良好的保肝作用。但同时本研究也发现，各项指标并没有随蓝莓总花青素剂量增长而呈现出相应的梯度变化，因此，推测中国野生蓝莓总花青素存在一个有效保肝剂量范围。