解毒通络保肾法对高糖刺激下小鼠足细胞PI3K/Akt信号通路活化相关因子ILK、Akt及足细胞凋亡率的影响

成光宇 丛婷婷 吕美香 郑菲菲 何泽

(长春中医药大学 1附属医院实验中心，吉林 长春 130021；2 2014级中西医结合内科硕士研究生；3 2016级中医内科硕士研究生；4附属医院内分泌代谢病科)

糖尿病肾病(DN)是肾小球系膜细胞增殖、肾小球基底膜(GBM)增厚、细胞外基质增多和肾小球硬化等原因造成的〔1〕。足细胞为肾小球滤过屏障组成部分的重要结构。解毒通络保肾散是治疗DN的有效中药处方，临床取得良好疗效〔2〕。本实验主要探讨解毒通络保肾散对高糖诱导的小鼠足细胞的保护机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 永分化小鼠足细胞(MPC-5)，购自上海复祥生物科技有限公司，解毒通络保肾散，由长春中医药大学附属医院中药房提供，低糖DMEM培养基(HyClone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco公司)，无水葡萄糖(北京化工厂)，磷酸盐缓冲液(PBS，HyClone)，整合素连接激酶(ILK)、蛋白激酶B(Akt)酶联免疫试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)，细胞凋亡试剂盒(贝博生物)。

1.2实验仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(北京诚茂兴业科技发展有限公司)，超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗)，酶标仪(美国BIORAD)，流式细胞仪(美国BIORAD)。

1.3实验方法

1.3.1小鼠足细胞的复苏、冻存与传代 细胞常规复苏用含10%胎牛血清和 DMEM低糖培养基在33℃、5% CO2培养箱中使其传代增生，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2含药血清的制备 解毒通络保肾散由红参10 g、生地黄15 g，枸杞子15 g，大黄12 g、黄芪15 g、金银花15 g、地龙10 g、丹参15 g、黄连12 g、金荞麦30 g组成。煎煮两次浓缩直至含生药1.125 g/ml。取Wistar大鼠16只,体重180～220 g，雄性，随机分为空白组、解毒通络保肾组。解毒通络保肾组大鼠每日灌胃2次，每次3 ml，连续5 d，末次给药1 h后腹主动脉取血，充分凝血后分离血清，56℃水浴灭活，-20℃冰箱保存备用。空白组大鼠灌服同等剂量的蒸馏水，与解毒通络保肾组同时采血，分离血清备用。

1.3.3造模药的配置 造模葡萄糖配置成最大浓度1 000 mmol/L，称取1 g葡萄糖放入10 ml离心管，加入5 046 μl磷酸盐缓冲液(PBS)，充分混匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，分装保存，用时稀释至造模浓度180 mmol/L。

1.3.4实验分组 正常糖组(A组)：加低糖DMEM培养基；高糖组(B组)：以高糖180 mmol/L刺激；C组：高糖+低剂量含药物血清组(0.60%)；D组：高糖+中剂量含药物血清组(1.25%)；E组：高糖+高剂量含药物血清组(2.50%)

1.3.5样本采集 ①处理细胞：细胞消化、传代方法及细胞计数方法同1.3.1。②铺板：将消化下来的细胞以1×105的浓度铺至96孔板，每孔100 μl，留一列作为空白组，只加培养液100 μl。置培养箱中培养24 h。③加药：设置空白孔、阴性对照孔、不同浓度含药血清组。空白孔和阴性对照孔加入培养液100 μl，造模样品孔加入含药血清和含葡萄糖的培养基100 μl使含药血清终浓度为0.000%、0.625%、1.250%、2.500%，每个浓度设6个复孔。④处理：置培养箱中培养24 h后吸出每孔的上清液，分装在1.5 ml离心管中，做好标记，封口膜封好每个离心管，将上清液冻存在-20℃冰箱中，等待下一步实验。

1.3.6酶联免疫吸附试验检测ILK、Akt 样本孔中先加入待测样本10 μl，再加入样本稀释液40 μl；空白孔不加。除空白孔以外，标准品孔与样本孔每孔各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体 100 μl，并用封板膜封住反应孔，37℃水浴箱中温育60 min。弃去液体，用吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min 后，甩尽试剂盒孔内液体，并用吸水纸拍干，如此反复洗板5次。每孔加入显色剂A与显色剂B各50 μl，37℃避光15 min。显色后除空白孔外其余均显蓝色；每孔加入终止液50 μl，此时蓝色立即转为黄色；15 min内，在 450 nm波长处测定各孔的光密度值(OD值)。

1.3.7流式细胞仪检测足细胞凋亡率 将足细胞接种于12孔板，分成5组，加药方法同上，24 h后每孔加入300 μl胰酶，消化1 min后加入600 μl培养基终止消化，反复吹打细胞收集至离心管中，每孔用预冷PBS冲洗1次，吹打后收集至上述离心管，500 r/min离心5 min后，弃上清液，用冷PBS洗细胞1次，吹打几下后，1 500 r/min离心5 min后，弃上清液，用1×结合液重悬细胞，每管400 μl，在悬液中加入5 μl异硫氰酸荧光素(FITC)，2℃～8℃避光15 min，加入10 μl碘化丙啶(PI)，2℃～8℃避光5 min，用流式细胞仪检测足细胞凋亡率。

1.3.8统计方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组ILK及Akt表达及足细胞凋亡率比较 与A组相比，B、C、D、E组ILK表达均显著增加(P<0.05，P<0.01)，与B组相比，C、D、E组ILK表达均降低，但只有D、E组差异统计学意义(P<0.05,P<0.01)；与A组比较，B、C、D、E组Akt表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)，与B组相比，C、D、E组Akt表达增加，但只有E组差异有统计学意义(P<0.01)。与A组相比，B、C、D、E组细胞凋亡率均显著增加(均P<0.01)，与B组相比，C、D、E组细胞凋亡率显著降低(均P<0.01)，与C组相比，D、E组凋亡率均显著降低(均P<0.01)。见表1。

3 讨 论

足细胞对维持肾小球滤过屏障的完整性起重要作用〔3〕。足细胞是避免机体蛋白质丢失的最后一道屏障，足细胞损伤或丢失可导致大量蛋白尿及肾小球硬化。足细胞是DM多种致病因素作用的靶点，同时也是DN重要的致病因素。

DN的主要病机是“毒损肾络”，消渴病日久，气血运行失常，产生气滞、痰凝、血瘀等病理产物。这些病理产物日久则会化生为毒邪，毒邪入侵浮络、孙络等伤及肾脏及肾络，导致肾脏功能与结构发生改变，从而发生DN〔4〕。ILK是一种存在于胞质内的丝/苏氨酸蛋白激酶，是重要的连接细胞内外信号的蛋白激酶，研究发现，ILK激活直接导致足细胞的丢失〔5〕。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信号通路是影响细胞凋亡的重要途径之一〔6〕，受体酪氨酸激酶与其配体结合发生磷酸化后激活PI3K，PI3K 活化后磷脂酰肌醇二磷酸(PIP)2生成磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PIP3和Akt N端的PH结构域结合，使Akt从细胞质转移到细胞膜上进一步被磷酸化，并作用于下一蛋白，发挥作用。

前期实验证明解毒通络保肾散可以抑制实验性DM大鼠肾脏肥大及高滤过，保护肾小球足细胞结构和功能〔7〕，本实验通过高糖刺激小鼠肾足细胞发现足细胞凋亡率升高，说明确实发生了DN，符合了中医毒损肾络、肾之体用俱损机制。本研究说明在高糖的刺激下ILK-P13K-AKt信号通路已经活化，凋亡已经开始发生。解毒通络保肾散能够减少ILK并增加Akt的表达，初步证明解毒通络保肾散对高糖刺激的足细胞的保护作用机制可能阻断ILK介导的PI3K/Akt信号转导通路，从而抑制足细胞凋亡，延缓DN的发生发展。