下调肌细胞增强因子2C基因对动脉粥样硬化血管内皮细胞增殖凋亡及核因子-κB信号通路的影响

马红梅 张津华 赵春水 郝彦超

(开封市中心医院神经内科，河南 开封 475000)

动脉粥样硬化(AS)是指发生在大中动脉管腔内的慢性炎症及纤维性增生性病变，是大部分脑血管病的病理基础，具有较高的发病率、致残率及死亡率，且发病机制较复杂〔1〕。血管内皮细胞与血管再生、血管舒张、炎症等血管生理学方面密切相关，有研究表明，内皮细胞损伤是导致AS和高血压的一个关键因素〔2〕。氧化应激被认为是引起内皮细胞发生损伤的一个主要病理因素〔3〕。因此，寻找有效的抗氧化应激方法对于脑血管疾病治疗具有重要意义。肌细胞增强因子(MEF)2C是MEF2家族成员之一，有研究表明，MEF2C可通过Kruppel样因子(KLF)2和核因子(NF)-κB抑制内皮细胞的炎症反应〔4〕，在受到氧气刺激时MEF2C可以负反馈形式抑制内皮细胞生成〔5〕。在AS斑块中MEF2C的表达量明显高于其在附近血管壁处表达量，miR-499a-3p和miR-135b-5p可靶向抑制MEF2C促进人皮肤微血管内皮细胞(HSMC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移〔6〕。但MEF2C对AS血管内皮细胞凋亡的影响及机制研究的尚未明确。因此，本研究使用H2O2建立血管内皮细胞氧化应激模型，通过RNA干扰MEF2C表达，检测MEF2C表达受到抑制后血管内皮细胞的活力及凋亡情况，并进一步研究其作用机制。

1 材料方法

1.1实验对象 人组织标本来源于开封市中心医院自2015年8月至2017年3月的AS患者斑块，共46例，其中男21例，女25例，年龄51.3～78.3岁，平均(66.2±11.1)岁。所有患者经血管造影确诊，且严格排除曾经有心绞痛、患有糖尿病及有心肌梗死病史的患者。以上患者在后期进行脑血管手术时切除斑块组织，同时切除部分正常血管组织作为正常对照组。组织采集后立即做好标记，并放入液氮中保存。本研究通过开封市中心医院伦理委员会的批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器 Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、噻唑蓝(MTT)溶液均购自美国Bibco；异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD；H2O2购自美国Sigma；核因子(NF)-κB p65、NFkappaB激酶抑制剂(IKK)α、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和GAPDH抗体均购自美国Abcam；酶标仪购自美国Bio Tek公司。

1.3细胞培养 人脐静脉血管内皮ECV-304细胞购自美国ATCC。细胞在含10% FBS及双抗的DMEM培养基中，于37℃、5%体积分数CO2培养箱中培养。实验选择生长至对数期的细胞。

1.4siRNA转染 MEF2C的特异性siRNA(si-MEF2C)及阴性对照组siRNA(NC)的设计参照siRNA设计原则，由上海吉玛合成。转染前1 d，以5×105/孔密度接种ECV-304细胞于6孔板，于37℃、5%体积分数CO2培养箱中培养，细胞达80%～90%融合密度时，将制备的siRNA-lip2000混合物加入至6孔板，转染参照LipofectamineTM2000说明，仅加脂质体的为空白对照组，48 h后，收集细胞用于实验研究。

1.5MTT检测细胞活力 ECV-304细胞分为3个处理组，即NC组、H2O2组和H2O2+si-MEF2C组。NC组ECV-304细胞转染阴性对照组siRNA 48 h，H2O2组ECV-304细胞先用0.5 mmol/L的H2O2刺激细胞4 h后转染阴性对照组siRNA 48 h，H2O2+si-MEF2C组先用0.5 mmol/L的H2O2刺激细胞4 h后转染MEF2C的特异性siRNA 48 h。以5×103个/孔密度接种生长至对数期的ECV-304细胞于96孔板，常规培养24 h后，参照上述分组处理细胞，收集处理至规定时间的三组细胞，加MTT溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，37℃孵育4 h，再在每孔中加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，充分震荡混匀10 min，酶标仪测定吸光度值(A值，490 nm)。实验重复3次。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 收集按照上述分组处理至规定时间的三组细胞，制备成单细胞悬液，收集1×106个细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤及1×结合缓冲液重悬细胞后，分别加入5 μl的AnnexinV-FITC 和10 μl的PI，避光环境孵育15 min，再加入1×结合缓冲液400 μl，1 h内，流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.7流式细胞术检测活性氧(ROS)含量 以5×104个/ml密度接种ECV-304细胞的细胞悬液于6孔板，每孔2 ml，于37℃、5%体积分数CO2培养箱中孵育24 h，按照上述分组处理后，加入终浓度为10 μmol/L的2′,7′-二氯荧光黄(DCF)双乙酸盐(DCFH-DA)工作液，避光孵育15 min，离心，收集细胞，PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测DCF的荧光强度，以此可反映出细胞的ROS水平。实验重复3次。

1.8Western印迹检测MEF2C表达 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液适量提取细胞总蛋白，二辛可宁酸(BCA)法定量蛋白样品，每孔道上样蛋白40 μg，经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)转膜、5%脱脂奶粉封闭，4℃孵育稀释好的一抗过夜(1∶500稀释的NF-κB p65、IKKα、PCNA、Bcl-2及内参GAPDH抗体)，洗膜，加1∶2 000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1 h，电化学发光(ECL)显色，显影、定量。以目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1MEF2C在AS患者斑块组织表达 AS患者斑块组织MEF2C蛋白表达(0.355±0.036)显著高于正常对照组(0.047±0.008；t=14.466，P<0.05)。见图1。

图1 MEF2C在AS患者斑块组织表达

2.2MEF2C siRNA转染ECV-304细胞效果 si-MEF2C组MEF2C蛋白表达(0.071±0.009)显著低于空白对照组(0.302±0.028)(P<0.05)，而NC组MEF2C蛋白表达(0.296±0.025)与空白对照组差异不显著(P>0.05)，三组差异显著(F=104.720，P=0.000)，见图2。

图2 MEF2C siRNA转染ECV-304细胞后MEF2C蛋白表达

2.3MEF2C siRNA对H2O2诱导的ECV-304细胞活力的影响 H2O2组细胞活力(0.417±0.038)显著低于NC组(0.823±0.066)(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C组细胞活力(0.679±0.051)显著高于H2O2组(P<0.05)。三组差异显著(F=45.390，P=0.000)。

2.4MEF2C siRNA对H2O2诱导的ECV-304细胞凋亡的影响 H2O2组细胞凋亡率〔(27.11±2.08)%〕显著高于NC组〔(3.36±0.38)%〕(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C组细胞凋亡率〔(11.56±0.74)%〕显著低于H2O2组(P<0.05)。三组差异显著(F=260.971，P=0.000)。见图3。

图3 MEF2C siRNA对H2O2诱导的ECV-304细胞凋亡的影响

2.5MEF2C siRNA对H2O2诱导的ECV-304细胞ROS水平的影响 H2O2组细胞ROS水平(2.567±0.213)显著高于NC组(1.000±0.000)(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C组细胞ROS水平(1.447±0.196)显著低于H2O2组(P<0.05)。3组差异显著(F=69.995，P=0.000)。

2.6MEF2C siRNA对H2O2诱导的ECV-304细胞NF-κB信号的影响 H2O2组细胞NF-κB p65和IKKα蛋白表达显著高于NC组，PCNA和Bcl-2的蛋白表达显著低于NC组(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C组细胞NF-κB p65和IKKα蛋白表达显著低于H2O2组，PCNA和Bcl-2的蛋白表达显著高于H2O2组(P<0.05)。见图4和表1。

图4 MEF2C siRNA对H2O2诱导的ECV-304细胞NF-κB p65、IKKα、PCNA和Bcl-2蛋白表达的影响

组别NF-κB p65IKKαPCNABcl-2NC组0.182±0.0200.151±0.0160.486±0.0500.243±0.024H2O2组0.803±0.0711)0.389±0.0421)0.132±0.0151)0.043±0.0071)H2O2+si-MEF2C组0.415±0.0392)0.206±0.0232)0.257±0.0262)0.192±0.0212)F/P值127.221/0.00059.128/0.00085.291/0.00091.185/0.000

与NC组比较：1)P<0.05；与H2O2组比较：2)P<0.05

3 讨 论

血管内皮病变是导致脑血管病发生的一个关键环节，炎症反应、氧化应激、黏附因子、机械损伤等多种因素均可引起内皮细胞损伤，其中氧化应激是导致血管内皮功能障碍的一个重要因素〔7〕。H2O2是机体产生的ROS，是重要的自由基形成源，近些年的多项研究表明，H2O2可诱导血管内皮细胞凋亡，而血管内皮细胞凋亡在AS发生发展过程中发挥重要作用〔8，9〕。脊柱动物中MEF2家族成员有四个，即MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D，MEF2蛋白在控制细胞增殖、凋亡、分化及多种信号传导等过程中均发挥重要作用〔10〕；MEF2C可通过抑制Toll样受体(TLR)/NF-κB信号降低AS的发展〔11〕。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的在转录后阻断基因表达的一项新技术，能高效性、特异性抑制目的基因表达，目前已在基因功能研究、疾病治疗等多个方面广泛应用〔12，13〕。本研究与上述研究结果一致。将合成的特异性干扰MEF2C表达的siRNA转染人ECV-304细胞，MEF2C的表达受到抑制，且MEF2C表达被抑制可明显提高由H2O2引起的ECV-304细胞活力降低，并可降低细胞的凋亡率及ROS水平。提示MEF2C表达抑制可降低AS血管内皮损伤。

NF-κB几乎存在于所有的真核细胞中，可调节生长因子、细胞因子、黏附分子、氧化应激相关酶等，功能涉及多种生理及病理过程〔14〕。NF-κB信号参与AS发生发展的多个环节。如枸杞多糖可通过抑制NF-κB信号、减轻氧化应激、抑制凋亡蛋白caspase-3表达等降低脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞损伤〔15〕。蓬子菜总黄酮对氧化损伤的血管内皮细胞具有保护作用，其机制可能是通过抑制NF-κB/IκB信号途径〔16〕。PCNA是一个在DNA合成过程中必需的核蛋白，其表达水平可反映细胞增殖，有研究表明，下调PCNA可抑制血管内皮细胞增殖〔17，18〕。Bcl-2是一个抑凋亡蛋白，属于Bcl-2家族成员之一，在包括AS在内的多种脑血管疾病中可检测到Bcl-2表达水平的降低〔19，20〕。本研究检测NF-κB信号通路NF-κB p65和IKKα及下游与增殖凋亡相关的PCNA和Bcl-2的表达，发现MEF2C表达抑制可降低由H2O2引起的ECV-304细胞NF-κB p65和IKKα表达升高，且上调PCNA和Bcl-2表达。这提示MEF2C对AS血管内皮细胞损伤保护与下调NF-κB 信号通路有关。

综上，下调AS血管内皮细胞MEF2C基因表达可提高细胞活力，抑制细胞凋亡，机制可能是细胞内ROS水平降低及NF-κB信号通路的下调。MEF2C可能是脑血管疾病治疗的一个关键分子，但还需更多体内及体外的研究证实。