TWSG1蛋白在颌面骨纤维异常增殖症患者组织中的表达及其与临床特征的相关性分析

伊燕军 徐旭 王真

[摘要] 目的 探討TWSG1蛋白在颌面骨纤维异常增殖症患者组织中表达及其与临床特征的相关性。 方法 以本院2010年4月～2013年7月收治的颌面骨纤维异常增殖症患者44例为病例组，同期选择口腔科外伤10例正常新鲜颌骨骨折患者作为对照组，酶联免疫吸附法、免疫组化法测定TWSG1蛋白的表达，分析TWSG1蛋白在各组中的表达水平及其与颌面骨纤维异常增殖症患者临床特征（性别、影像CT分类、年龄、病变部位、术后复发）的相关性。 结果 病例组与对照组的性别、年龄、吸烟、饮酒分布及BMI、收缩压、舒张压水平相似，差异无统计学意义（P>0.05）;病例组TWSG1蛋白水平表达水平为（146.98±15.14）ng/g，高于对照组（19.87±9.76）ng/g（t=25.281，P<0.01）;病例组TWSG1蛋白阳性率为81.8%，明显高于对照组的10.0%（χ2=19.483，P<0.01）;TWSG1蛋白表达与性别、影像CT分类相关性不明显（χ2=0.081、2.546，P>0.05）;与年龄、病变部位、术后复发相关性明显，年龄<20岁、病变部位为多骨型，TWSG1蛋白阳性表达率越高（χ2=6.210、7.283，P<0.05）;术后有复发颌面骨纤维异常增殖症患者其TWSG1阳性表达率为92.8%，高于术后未复发者TWSG1阳性表达率（62.5%）（χ2=6.308，P<0.05）。 结论 TWSG1与颌面骨纤维异常增殖症的进展预后密切相关，其机制可能与TWSG1促进成骨细胞分化有关，TWSG1可能成为颌面骨纤维异常增殖症治疗的分子靶点。

[关键词] TWSG1;颌面骨;纤维异常增殖症;临床特征;相关性

[中图分类号] R782          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）01-0005-04

Expression of TWSG1 protein in tissues of patients with maxillofacial fibrous dysplasia and its correlation with clinical features

YI Yanjun XU Xu WANG Zhen

Department of Stomatology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of TWSG1 protein in tissues of patients with maxillofacial fibrous dysplasia and its correlation with clinical features. Methods A total of 44 cases of maxillofacial fibrous dysplasia from April 2010 to July 2013 in our hospital were included in the case group. Ten patients with normal fresh jaw fractures who underwent stomatological trauma were selected as control group in the same period. The expression of TWSG1 protein was measured by enzyme-linked immunosorbent assay and immunohistochemistry. And the expression of TWSG1 protein in each group and its correlation with the clinical features of maxillofacial fibrous dysplasia （sex， CT classification， age， lesion location， postoperative recurrence） was analyzed. Results There was no significant difference in gender， age， smoking， alcohol consumption distribution， BMI， systolic blood pressure and diastolic blood pressure between the case group and the control group（P>0.05）. The expression level of TWSG1 protein in the case group was （146.98±15.14） ng/g， which was higher than that （19.87±9.76） ng/g of the control group （t=25.281， P<0.01）.The positive rate of TWSG1 protein in the case group was 81.8%， which was higher than that of the control group （10.0%） （χ2=19.483， P<0.01）. TWSG1 protein expression was not significantly correlated with gender and imaging CT classification（χ2=0.081， 2.546， P>0.05）， while was significantly correlated with age， lesion location， postoperative recurrence. When the age was less than 20 years old， and lesion location was multi-bone type， the positive rate TWSG1 protein expression was higher （χ2=6.210， 7.283， P<0.05）. The positive expression rate of TWSG1 was 92.8% in patients with postoperatively recurrent maxillofacial fibrous dysplasia， which was higher than that of patients who had no recurrence after surgery（62.5%） （χ2=6.308， P<0.05）. Conclusion TWSG1 is closely related to the prognosis of maxillofacial fibrous dysplasia， and its mechanism may be related to the promotion of osteoblast differentiation by TWSG1. TWSG1 may become a molecular target for the treatment of maxillofacial fibrous dysplasia.

[Key words] TWSG1; Maxillofacial bone; Fibrous dysplasia; Clinical features; Correlation

骨纤维异常增殖症是一种病因不明、进展缓慢、先天非遗传性的自限性良性骨纤维组织疾病[1-2]。男女均可患病，比例约为1∶2，本病绝大多数发生于20岁以前，病因尚不明确，某些原因导致的局部血液循环障碍、内分泌功能紊乱、外伤、感染可能与之有关[3]。由于骨的间质分化不良、网状骨未成熟期骨停滞，在病理上表现为质梭形细胞的纤维组织和发育不良的网状骨骨小梁取代正常骨小梁[4]。临床上颌面骨纤维异常增殖症的症状如下：颌面部的骨区有畸形肿胀的现象，面部的两侧不对称，鼻腔变窄，眼球有突出和移位状况，牙齿会出现松动，随着病情的加重还会产生头痛[5]。我国颌面骨纤维异常增殖症发病率日渐升高，约有86万患者，严重影响了患者的生活质量，每年我国在颌面骨纤维异常增殖症治疗上的支出多达120亿元人民币，给社会带来沉重负担[6]。TWSG1蛋白（Twisted Gastrulation，TWSG1）是一种分子量为23.5 KDA的分泌糖蛋白，在细胞外空间与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）结合，发挥增效和拮抗的作用，进而激活成骨细胞相关功能[7]。TWSG1蛋白在哺乳动物的脂肪组织、血管平滑肌组织、骨骼、心肌组织、胎盘中均有表达，利用各种受体的分子、生长因子以及多功能蛋白，调控细胞的变化过程，促进了细胞的增殖[8]。本研究拟探讨TWSG1蛋白在颌面骨纤维异常增殖症患者组织中表达及其与临床特征的相关性分析，为颌面骨纤维异常增殖症的治疗提供理论及临床依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年4月～2013年7月在我院口腔颌面外科确诊有完整随访资料的颌面骨纤维异常增殖症患者44例，所有患者行辅助检查：血常规、尿常规、血生化检查，经临床表现（颌面骨肿大畸形、病变区域疼痛向周围反射）、影像CT学及病理学确诊，其中毛玻璃样型16例、结节状硬化型14例、囊样型14例。患者病患处窦腔、窦管、窦孔闭塞、变形缩小，正常骨小梁结构溶解消失，覆盖以密度不均匀的无小梁结构区，皮质变薄。病变部位单一累及上颌骨3例、筛骨4例、下颌骨5例、蝶骨3例;混合累计29例;年龄16～56岁，平均（36.35±11.26）岁，病程4～13年，其中男20例，女24例，吸烟18例、饮酒15例，收缩压104.35～138.16 mmHg，平均（122.74±19.85）mmHg，舒张压60.32～89.42 mmHg，平均（68.74±14.91）mmHg，BMI 22.45～23.99 kg/m2，平均（23.54±2.36）kg/m2。44例颌面骨纤维异常增殖症患者中高血压7例、冠心病3例、高血脂3例，患者均无既往肺栓塞病史、惡性肿瘤、6周内手术史、下肢外伤史、长期卧床史，签署知情同意书。选择同期我院口腔科外伤10例正常新鲜颌骨骨折碎片组织标本作为阴性对照。两组在性别、年龄、吸烟、饮酒分布及BMI、收缩压、舒张压水平方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

纳入标准：①无精神障碍史，能够进行自由的沟通与交流;②具备生活自理的能力，在意识方面比较清醒;③各组患者需要对知情书进行签署，也可由他们的直系亲属代签。

排除标准：①有较为严重的精神病史和心源性休克症状;②在本次治疗期间，同时有其他放疗;③患者心肝功能较弱，存在一些急性的炎症，或者有血液病。

1.2 ELISA法测定TWSG1蛋白水平

此次实验所用的器具预先使用高压进行灭菌和烘干操作，严格遵循无菌操作规范。将保存在液氮罐中的病例组颌面骨纤维异常增殖组织及对照组颌骨骨折碎片组织取出解冻。准确称取0.2 g颌面骨纤维异常增殖组织及颌骨骨折碎片组织，微波粉碎器速将其碾碎至粉末状;将组织粉末转入2 mL Eppendorf管中，加入1.5 mL PBS（pH7.4），充分振荡混匀，2000 g，4℃，静止1 h，然后离心20 min。仔细收集上清液。获取颌面骨纤维异常增殖组织及颌骨骨折碎片组织匀浆后， ELISA法（试剂盒购于南京金益柏生物科技有限公司）检测颌面骨纤维异常增殖组织及颌骨骨折碎片组织中的TWSG1蛋白表达量。

1.3 TWSG1在颌面骨纤维异常增殖组织及颌骨骨折碎片组织中表达水平的测定

免疫组化方法测定TWSG在颌面骨纤维异常增殖组织及颌骨骨折碎片组织中的表达，对骨骼组织常规脱钙，制作常规5 μm石蜡切片，3% H2O2液常温阻断内源性过氧化氢酶活性，微波修复抗原，PBS常规冲洗，1%TWSG抗体工作液（购于英国Abcam公司），4℃过夜，加入二抗（IgG），室温30 min，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。TWSG1染色阳性为骨母细胞和成纤维细胞的细胞浆/核，以细胞质呈黄色或棕色者为阳性，无黄染者为阴性。采用双盲法统计结果，随机选取5个高倍视野（×400）计数，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，同时计数;>50%为（+++），26%～50%为（++），6%～25%为（+），阳性细胞≤5%为（-），（-）及（+）归为不表达组或低表达组，（++）及（+++）归为高表达组。

1.4 统计学方法

通过Epidata、SPSS19.0导入相关的数据，并进行统计分析。TWSG蛋白以均数±标准差（x±s）进行表示，并预先实施正态检验，若正态性得到满足，则使用t检验进行比较，若正态性不能满足，则在转换数据之后，进行单因素方差分析，然后使用t检验进行比较;TWSG蛋白的表达情况与颌面骨纤维异常增殖症患者临床病理特征的关系采用χ2检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组TWSG1蛋白水平的表达

实验结果，对照组的TWSG1为（19.87±9.76）ng/g，病例组的TWSG1为（146.98±15.14）ng/g，病例组TWSG1蛋白水平表达水平高于对照组（t=25.281，P<0.01）。

2.2 两组TWSG1蛋白表达的相关性分析

由表2及封三图2可见，对照组高倍视野的阳性细胞为10.0%，属于（+）类，为低表达组;病例组高倍视野的阳性细胞为81.8%，属于（+++）类，为高表达组。病例组TWSG1蛋白阳性率高于对照组（χ2=19.483，P<0.01）。

2.3 TWSG1蛋白表达与临床病理特征的关系

由表3可見，TWSG1蛋白表达与性别、影像CT分类相关性不明显（χ2=0.081、2.546，P>0.05）;与年龄、病变部位相关性明显，年龄<20岁、病变部位为多骨型，TWSG1蛋白阳性表达率越高（χ2=6.210、7.283，P<0.05）。

2.4 TWSG1蛋白表达与颌面骨纤维异常增殖症患者术后复发的相关性分析

由表4可见，TWSG1蛋白表达与术后复发相关性明显，术后有复发，TWSG1蛋白阳性表达率越高（χ2=6.308，P<0.05）。

3 讨论

TWSG1是与果蝇蛋白RUNT具有高度同源性的骨相关转录因子，对于间充质细胞向成骨细胞的分化以及骨基质的矿化是必不可少的[9]。小鼠TWSG1的缺失可以导致成骨细胞功能障碍，而人类的RUNT基因发生突变，则可产生锁骨颅骨发育不良综合征，这是一种常染色体显性遗传性疾病，其特征为锁骨缺失、囟门开放、牙齿多生、身材矮小。TWSG1的分子结构域包括3个部分：1、富含谷氨酰胺/丙氨酸的N-末端区（Q/A）;2、具有与果蝇RUNT蛋白高度同源性的中间RUNT区域;3、含有DNA结合区域以及富含脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸的C-末端区（P/S/T）[10-12]。（P/S/T）区域极其重要，因为TWSG1可通过这一区域激活成骨细胞相关基因，这些基因主要有骨钙素（Osteocalcin，OCN）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein，BSP）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）等[13-14]。

本研究结果显示，病例组TWSG1蛋白表达水平高于对照组，病例组TWSG1蛋白阳性率高于对照组，这提示TWSG1在颌面骨纤维异常增殖症中，具有促进成骨细胞分化的作用。TWSG1与成骨细胞相关基因的表达不一致，在时间关系上，TWSG1先于OCN的表达[15];而在前成骨细胞向成骨细胞分化的过程中，成骨细胞标志物OCN、BSP、ALP都急剧增加，但是TWSG1却没有显著变化。这些研究均暗示，TWSG1对成骨细胞相关基因的调控密切相关。

此外，TWSG1对骨纤维细胞的发生与发展起到一定的影响。研究发现：TWSG1能够促进骨纤维细胞朝一定方向转移，并对淋巴、上皮、中性粒、内皮等部位的细胞进行激活[16]。TWSG1促进了骨纤维细胞的增殖启动，抑制细胞的凋亡，它比野生株的增殖能力更高。TWSG1的骨纤维细胞还会粘附在细胞的外基质[17]。有研究发现，IL-8、血管内皮生长因子（VEGF）有可能由TWSG1调控，高表达TWSG1蛋白的成骨细胞可促进IL-8、血管及VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在促进骨纤维异常增殖的发展过程中发挥重要作用[18-20]。

本研究结果中，TWSG1蛋白表达与性别、影像CT分类相关性不明显;与年龄、病变部位、术后复发相关性明显，年龄<20岁、病变部位为多骨型、术后有复发，则TWSG1蛋白阳性表达率越高，这提示 TWSG1与颌面骨纤维异常增殖症的进展预后密切相关，综合TWSG1在骨瘤细胞患者的表达，发现骨瘤细胞患者TWSG1蛋白表达异常增高，且随着骨瘤细胞患者T分期的进展，TWSG1蛋白表达逐渐增高，TWSG1能够很好地调控骨瘤细胞的发生与发展，具备了时间和空间的表达特异性，若药物沉默TWSG1蛋白表达，则不能有效促进骨瘤细胞的生长，说明TWSG1有可能作为颌面骨纤维异常增殖症治疗的分子靶点。

综上所述，TWSG1与颌面骨纤维异常增殖症的进展预后密切相关，其机制与TWSG1促进成骨细胞分化有关，TWSG1可能成为颌面骨纤维异常增殖症治疗的分子靶点。

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