多杀菌素粗品精制工艺研究

黄金竹

多杀菌素（spinosad）是由放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的一种大环内酯类高效安全的生物杀虫剂，其主要活性成分为多杀菌素A（约85%～90%）和多杀菌素D（约10%～15%）;多杀菌素由美国陶氏益农公司开发，因其具有不同于其他各类杀虫剂的独特作用机理，对昆蟲的选择性和对害虫综合治理的适应性，能通过多途径在环境中被降解以及对哺乳动物、鸟类、水生生物等的低毒性等特点，获得了美国“总统绿色化学品挑战奖”，已被广泛用于防治鳞翅目害虫、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾等，同时对直翅目、鞘翅目害虫也有很好的效果。

多杀菌素是亲酯性的，在水中溶解度较小，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸丁酯和乙腈等有机溶剂。目前多杀菌素分离纯化的方法主要有溶媒萃取法、柱层析分离法和离子交换法。国内对多杀菌素制备工艺的研究尚未形成高效、高收率的工业生产技术，制备的多杀菌素粗品A+D的含量基本在86%左右，其余的是杂质，本研究主要通过硅胶柱层析法对多杀菌素粗品进行精制，获得高纯度多杀菌素（A+D）产品，为多杀菌素工业化生产提供一定的理论依据和参考。

一、实验设计

（一）原料、试剂与仪器

多杀菌素粗提物浓缩液（实验室自制）和对照品（美国陶氏益农公司），高效液相色谱仪（安捷伦），硅胶（200～300目）：青岛海洋化工有限公司，旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司

（二）方法与过程

（1）硅胶活化。首先将一定量的硅胶装入搪瓷盘中，放置入烘箱中于110℃活化4h后取出冷却至室温，密封保存备用。

（2）多杀菌素粗品制备。多杀菌素发酵液本实验室提供，效价2.3g/L，发酵液通过树脂吸附，树脂脱色，然后进行浓缩，石油醚浸提浓缩液，然后用2%酒石酸水溶液反萃取，水相调pH值在10.0搅拌结晶得到多杀菌素粗品。

（3）硅胶层析法制备多杀菌素精品。湿法装柱：量取200mL硅胶，加入正庚烷搅拌至没有气泡后缓慢倒入层析柱中，倒入完全后使用洗耳球不断敲打柱身直至硅胶不在下沉。然后取多杀菌素粗品5g溶解于正庚烷中，加入硅胶柱上面，缓慢流下。

使用1倍柱体积的正庚烷冲洗硅胶柱，后依次以正庚烷/丙酮（2：0.2，2：0.5，2：0.8，2：1）（V/V）进行冲洗洗脱，洗脱过程中使用TLC跟踪检测，虽然层析柱上有大量颜色被截住了，但是根据TLC结果显示，在正庚烷/丙酮（2：0.5，2：0.8）时产品洗脱下来，同时大量杂质一同被洗脱下来。合并相同流分，减压浓缩，浓缩液用正己烷溶解，2%酒石酸水溶液反萃取后调pH10.0搅拌结晶，得到纯白色粉末。

（4）多杀菌素的HPLC检测。取粗品和精品分别用甲醇溶解，过滤后进行HPLC分析，检测条件为：C18反相柱;（4μm，8mm×100mm）;流动相为乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10，含0.05%乙酸铵;进样量为10μL;流速为1.0mL/min;检测波长为250nm。根据多杀菌素A和D组分的积分面积，参照标准品计算其质量浓度，两组分之和为多杀菌素含量。检测图谱如下：（1）粗品，（2）精制品。

二、结果与讨论

多杀菌素发酵液经过初步纯化后产品主组分（A+D）的液相检测纯度大约在86%左右，为了提高多杀菌素的纯度，采用硅胶柱层析进行了进一步的精制研究。本研究选用了正庚烷/丙酮为洗脱液进行梯度洗脱，最终得到了纯度为99%以上的多杀菌素纯品，回收率74.8%。

参考文献：

[1]陈小龙，郑裕国，沈寅初.农用抗生素刺糖菌素（Spinosads）的研究进展[J].农药，2002，（1）.

[2]徐志红，蒋志胜.生物杀虫剂多杀菌素的中毒症状和作用机理[J]. 农药科学与管理，2004，（2）.

[3]夏燕春，王超，吴江磊等.多杀菌素分离纯化工艺的研究[J].中国粮油学报，2014，（3）.