腹腔注射鸡血藤醇提物对黄颡鱼免疫相关指标及抗病力的影响

张红霞，王 洋，杨 广，曾祥茜，朱国霞，方珍珍，刘晋菘，张宝龙，吴 旋，白东清

（1.天津农学院水产学院/天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.天津渤海水产研究所，天津 300457；3.天津现代晨辉科技集团有限公司，天津 301800；4.天津市静海区畜牧水产业发展服务中心，天津静海 301600）

鸡血藤为豆科密花豆的干燥藤茎，是一味富含黄酮类化合物的中草药，主要分布于广东、广西及云南等地区［1］。通过现代药理学分析可知，鸡血藤具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、调节脂代谢等作用［2-5］。鸡血藤成分复杂，其醇提物的主要活性成分为黄酮。黄酮是一类化合物，普遍具有消除自由基、抑菌抗癌及调节脂代谢的活性［6］。可见富含黄酮的鸡血藤醇提物具有广阔的应用前景。

黄颡鱼属于鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，广泛分布于我国各大水系之中，是一类小型淡水经济鱼类。黄颡鱼鱼肉氨基酸含量丰富，肉质细嫩、味道鲜美、营养价值高、无肌间刺，且具有滋补作用和药用价值，得到消费者普遍认可，是目前国内主要养殖鱼类品种之一［7-8］。然而，近年来由于养殖密度增加，黄颡鱼疾病频发，发病池塘死亡率高，造成严重经济损失，制约了黄颡鱼养殖业的健康可持续发展。基于上述原因，本试验通过腹腔注射方式探究鸡血藤醇提物对黄颡鱼非特异性免疫能力与血脂水平的影响，为鸡血藤醇提物作为黄颡鱼饲料免疫增强剂提供前期数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

同一批次720尾健康全雄黄颡鱼，购自天津蓝科水产养殖有限公司。初始体质量为（34.23±1.43）g，初始体长为（14.12±0.28）cm。鸡血藤醇提物粉末，购自西安瑞林生物科技有限公司，使用前用无菌生理盐水（0.85%）分别稀释成60、120、240、480、960 mg/L。

饲料采用鱼粉、豆粕、花生粕、豆油等原料配制，以上原料均购自天津市天祥水产有限责任公司。配制的饲料营养组成为：粗蛋白含量38.75%、粗脂肪含量6.23%、粗灰分含量10.13%、粗水分含量6.35%、钙含量1.26%、磷含量1.90%。

嗜水气单胞菌由中国农业科学院饲料研究所赠送。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计及养殖管理 养殖试验在天津蓝科水产养殖有限公司一栋700 m2孵化车间内进行，使用直径1.5m，高度0.75 m的圆形孵化桶18个，将所选取的720尾黄颡鱼随机分为6组，每组设置3个重复，每个重复养殖40尾鱼。其中1组注射生理盐水1 mL标记为Z1，为对照组，其余5组鱼分别注射1 mL质量浓度为60、120、240、480、960 mg/L的鸡血藤醇提物溶液，依次标记为Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。注射后养殖7 d，每个平行随机选取10尾鱼取血解剖并取相应组织，测定各项生理生化指标。每个平行取10尾鱼继续养殖，用于攻毒试验。养殖期间24 h连续增氧，每天于09：00、17：00进行投饵，日换水量1/3。

1.2.2 血液及组织采集 养殖7 d后，首先取尾静脉血，4 500 r/min离心15 min取上清液，制得血清样品，于-80℃冻存待测。然后在冰浴条件下解剖，取鳃、脑、头肾、中肾、肝胰脏、脾脏，用镊子剔除掉结缔组织和脂肪组织后用生理盐水冲洗干净，称取组织0.4 g后加9倍体积的0.85%生理盐水制成10%的匀浆液，然后在4℃4 000 r/min离心20 min，静止5 min后，吸取上清液转移至2 mL离心管中，暂存于-80℃超低温冰箱，用于测定生理生化指标。

1.2.3 生理生化指标的测定 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、白蛋白（ALB）、补体C3、免疫球蛋白（IgM）活性均采用南京建成公司试剂盒，依照说明书进行。

1.2.4 攻毒致死率测定 选取注射不同浓度鸡血藤醇提物的黄颡鱼，每箱取10尾鱼，每个处理30尾，按每100 g体质量0.2 mL的比例腹腔注射嗜水气单胞菌菌液（活化好的嗜水气单胞菌，以无菌PBS缓冲液调浓度至2×108CFU/mL），继续饲养7 d，每天定时记录各组死亡尾数情况，试验结束后计算各组鱼的累计死亡率和免疫保护率。

免疫保护率＝（1-N2/N1）×100%；

累计死亡率＝H2/H1×100%。

式中：N1为对照组死亡率，N2为试验组死亡率，H1为受感染鱼尾数，H2为终死亡鱼尾数。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0软件对原始数据进行One-ANOVA处理，以0.05作为差异性显著水平，表格中试验数据用表示。

2 结果与分析

2.1 腹腔注射鸡血藤醇提物对黄颡鱼生理生化指标的影响

2.1.1 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内SOD活性的影响 各组黄颡鱼组织中SOD活性从高到低为中肾＞肝胰脏＞头肾＞鳃＞血清＞脾脏＞脑。与对照组相比，注射鸡血藤醇提物相同组织的SOD活力有所提高（表1）。头肾、脾脏、鳃中SOD活力随着鸡血藤醇提物浓度的增加而上升（P＜0.05）。注射组黄颡鱼脑中SOD活力均显著高于Z1（P＜0.05），试验组之间变化不明显（P＞0.05）。Z5和Z6组显著提高了肝胰脏和中肾中SOD活力（P＜0.05）。其中Z6组中肾和肝胰脏酶活力分别是对照组的1.14倍和1.13倍（P＜0.05）。当鸡血藤醇提物质量浓度增加至960 mg/L（Z6）时，血清SOD活力上升为对照组的1.06倍（P＜0.05）。

表1 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内SOD活性的影响

2.1.2 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内CAT活性的影响 由表2可知，对照组及各处理组黄颡鱼体内CAT活性均为脑中最高，其次为肝胰脏、鳃、中肾、头肾和脾脏。除Z2组中肾和脑外，其余注射鸡血藤醇提物组的各组织CAT活性均显著高于对照组（P＜0.05）。随着鸡血藤醇提物浓度的增加，黄颡鱼肝胰脏、脾脏、中肾、头肾和脑中CAT活性逐渐升高，并在Z6组达到最高值。Z6组肝胰脏CAT活性为（198.55±8.56）U/mg蛋白，是对照组的1.93倍（P＜0.05），脾脏CAT活性（7.53±0.91）U/mg蛋白，为对照组的1.75倍（P＜0.05），Z6组中肾、头肾CAT活力分别上升至对照组的2.44倍和1.80倍（P＜0.05）。Z2～Z5组黄颡鱼的鳃和血清中CAT活力均高于对照组，但各组间没有显著差异，同样是在Z6组出现了最高值，CAT活性分别为（106.97±4.63）U/mg蛋白和（74.98±3.13）U/mg蛋白（P＜0.05）。

表2 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内CAT活性的影响

2.1.3 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内MDA含量的影响 由表3可知，注射鸡血藤醇提物降低了各组织中MDA的含量，但降低效果在不同组织中略有不同。肝胰脏、鳃和血清中MDA含量随鸡血藤质量浓度的增加呈现明显的下降趋势，并在Z6组降至最低，分别为（0.32±0.01）、（1.22±0.11）nmol/mg蛋白和（7.72±0.32）nmol/mL（P＜0.05）。但Z3组肝胰脏MDA含量与对照组无显著差异（P＞0.05）。最低质量浓度的鸡血藤醇提物（Z2）对中肾和头肾MDA含量没有影响（P＞0.05），Z3～Z6组中肾和头肾MDA含量随着鸡血藤质量浓度的增加而降低。Z4～Z6鸡血藤处理组脾脏的MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）。Z2、Z4和Z6组脑中MDA含量显著低于对照组，其中Z6组含量最低，为（8.44±0.70）nmol/mg蛋白（P＜0.05）。而Z3、Z5组脑中MDA含量与对照组无差异（P＞0.05）。

表3 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内MDA含量的影响

2.1.4 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内GSH含量的影响 由表4可知，注射鸡血藤醇提物提高了各组织中GSH的含量，中肾除Z5显著降低外，其余各组与对照组无明显差别，但提高效果在不同组织中略有不同。肝胰脏、脾脏、头肾、脑、血清中GSH的含量随着鸡血藤浓度的增加，呈现明显的上升趋势，并在Z6组升至最高，分别为（55.16±1.22）、（36.13±3.55）、（37.83±0.95）、（18.43±7.78）μmol/g蛋白和（321.05±17.73）μmol/mL（P＜0.05）。仅Z5和Z6处理组鳃的GSH含量较对照组有所提高，其中Z6组含量最高（P＜0.05），为（17.05±2.99）μmol/g蛋白，而低浓度组与对照组无显著差异（P＞0.05）。

表4 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内GSH含量的影响

2.1.5 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内GSH-Px活性的影响由表5可知，注射鸡血藤醇提物提高了各组织中GSH-Px的活性。肝胰脏、脾脏、头肾、脑、血清中GSH-Px活性随着鸡血藤浓度的增加，呈现明显的上升趋势，并在Z6组升至最高，分别为（140.64±21.16）、（23.89±0.17）、（139.44±4.79）、（16.63±3.28）μmol/g蛋白和（89.67±7.46）μmol/mL（P＜0.05）。而中肾在Z5组升至最高，为（54.29±2.21）μmol/g蛋白（P＜0.05）。高浓度鸡血藤处理组（Z5～Z6）鳃的GSH-Px活性显著高于对照组，其中Z6组活性最高，为（18.36±1.28）μmol/g蛋白（P＜0.05），而低浓度组与对照组无显著差异（P＞0.05）。

2.1.6 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内NO含量的影响 如表6可知，各处理组黄颡鱼体内NO含量为鳃＞肝胰脏＞血清＞脾脏＞脑＞中肾＞头肾。注射鸡血藤醇提物对各组织及血清中NO含量的影响不同。血清中NO含量随着鸡血藤醇提物浓度的增加呈逐渐上升的趋势，并在Z5和Z6组达到最高值，分别为（4.84±0.69）、（4.63±0.28）μmol/mL（P＜0.05）。而脾脏、头肾、鳃、脑中NO含量随着鸡血藤醇提物浓度的增加而均呈逐渐下降的趋势；Z4组脾脏与Z1组差异最为显著，下降了30.3%（P＜0.05）；Z6组头肾NO含量与对照组相比下降了55.6%（P＜0.05）；鳃和脑中NO含量均在Z4、Z5和Z6组中与Z1组相比显著下降，而Z2、Z3组与对照组相当（P＞0.05）。注射鸡血藤醇提物对肝胰脏和中肾NO含量无显著影响（P＞0.05）。

表5 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内GSH-Px活性的影响

表6 鸡血藤醇提物对黄颡鱼体内NO含量的影响

2.1.7 鸡血藤醇提物对黄颡鱼肝胰脏和血清转氨酶活性的影响 各处理组黄颡鱼体内2种转氨酶GOT和GPT的活性均为肝脏中较高，而血清中较低。与对照组相比，注射鸡血藤醇提物的黄颡鱼肝胰脏中GOT、GPT活性均随着鸡血藤浓度的上升而增加，在Z6组达到最高值，分别为（151.44±5.43）IU/g蛋白和（146.78±6.68）IU/g蛋白，为对照组的1.43倍和1.22倍（P＜0.05）。而血清中GOT、GPT活性均随鸡血藤浓度的增加而呈逐渐下降的趋势，在Z6组降至最低。与对照组（Z1）相比，分别下降了39.6%和48.0%（P＜0.05）。血清中GOT/GPT的比值随鸡血藤醇浓度变化的规律不明显，Z2和Z3组略高于对照组，而Z4和Z5组低于对照组，Z6组与对照组接近（P＞0.05）。

表7 鸡血藤醇提物对黄颡鱼转氨酶活性的影响

2.1.8 鸡血藤醇提物对黄颡鱼血清其他免疫相关指标的影响 由表8可知，注射鸡血藤醇提物7 d后，黄颡鱼血清中补体C3、白蛋白含量随着鸡血藤醇提物浓度的增加而逐渐上升，均在Z6组出现最大值，分别为（183.94±6.20）mg/L和（37.03±2.58）g/L，是对照组的3.12倍和1.74倍（P＜0.05）。注射鸡血藤醇提物对黄颡鱼血清中球蛋白含量没有显著影响（P＞0.05）。

2.1.9 鸡血藤醇提物对黄颡鱼抗病力的影响 由表9可知，鸡血藤醇提物对黄颡鱼抗病力的影响，注射鸡血藤醇提物显著降低了嗜水气单胞菌攻毒黄颡鱼的累计死亡率，提高了免疫保护率，且死亡率随着鸡血藤醇提物浓度的增加而下降。最高剂量组Z6组死亡率仅有（42.5±3.45）%，较对照组下降了34.6%（P＜0.05）。免疫保护率随着鸡血藤浓度的增加而上升，在Z6组达到最大值37.0%。

3 讨论

生物细胞内普遍含有SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶，可以清除细胞代谢过程中产生的自由基，保护细胞生物大分子不受损伤，防止过氧化物MDA等的产生［9-10］。其中，SOD将氧自由基转化为 H2O2，H2O2再被 CAT等转化为H2O［11-12］。GSH-Px可以通过催化谷胱甘肽（GSH），将有毒的过氧化物转化为无毒的羟基化合物，起到保护细胞膜结构和提高抗氧化能力的作用。本研究发现，腹腔注射鸡血藤醇提物后，黄颡鱼血清及各组织中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH、NO含量显著提高，同时代表脂质过氧化的MDA含量下降，表明鸡血藤醇提物提高了黄颡鱼的抗氧化能力［13］。这可能与鸡血藤具有清除自由基和抗氧化的作用相吻合［14-15］。NO是细胞间传递信息的重要物质之一，并且具有介导炎症反应及细胞免疫等功能［16-17］；机体在炎症状态下，巨噬细胞产生大量NO，与超氧阴离子等氧自由基反应，产物对细胞有毒性［18-19］；本试验中鸡血藤醇提物降低了脾脏、头肾、鳃和脑中NO的含量，说明鸡血藤醇提物不会造成由NO引起的组织损伤。鸡血藤醇提物小幅度提高了黄颡鱼血清中NO含量，可能发挥积极的免疫调节作用。

表8 鸡血藤醇提物对黄颡鱼血清其他免疫指标的影响

表9 鸡血藤醇提物对黄颡鱼抗病力的影响

腹腔注射鸡血藤醇提物降低了黄颡鱼肝胰脏及血清转氨酶的活性，并且降低了GOT/GPT比值。GOT和GPT是氨基酸代谢过程中2个重要的氨基转移酶，是鉴定肝损伤的标志性指标。人类GOT/GPT比值越大时说明肝损伤越发严重，GOT/GPT比值＞2时为酒精肝，比值＞1时为慢性乙肝。目前鱼类GOT/GPT比值与其肝损伤程度的关系尚不明确，对照组GOT/GPT比值为1.87，注射鸡血藤的Z6组为1.75，较对照组有所下降。若参考人类转氨酶比值，说明腹腔注射鸡血藤醇提物可以降低肝损伤。鸡血藤的护肝作用在哺乳动物中也有报道［20］，但其作用机制还有待深入研究。

腹腔注射鸡血藤醇提物增加了黄颡鱼血清其他免疫指标（补体C3、白蛋白）的水平，并且可以降低嗜水气单胞菌攻毒后的累计死亡率，提高免疫保护率。鱼类属于低等脊椎动物，其特异性免疫结构尚不完善。补体C3、白蛋白和球蛋白（IgM）是鱼体重要的免疫指标，其中补体C3含量最多，在多种免疫调节中起到关键起始作用［21］。本试验中黄颡鱼血清补体C3含量随着注射鸡血藤浓度的增加而逐渐上升。白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质，主要承担着体内贮存运输、维持血液胶体渗透压、清除自由基等作用［22］。本试验中黄颡鱼血清白蛋白呈逐渐上升的趋势，并在Z6组达到最大值。IgM含量在鱼类免疫球蛋白中含量最为丰富，注射鸡血藤醇提物并未改变血清中球蛋白含量，可见鸡血藤主要提高免疫相关指标活性，从而提高黄颡鱼的抗病力。

4 结论

腹腔注射鸡血藤醇提物可有效提高黄颡鱼免疫力以及抗病力，鸡血藤醇提物浓度为960 mg/L效果最好。鸡血藤醇提物有望作为免疫增强剂应用于黄颡鱼养殖中。