副干酪乳杆菌L9对口腔致病菌的黏附抑制作用

韩雨婷，吴怡婷，李睿佳，赵亮，张明，*

（1.北京工商大学食品学院，北京100048；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

口腔致病菌黏附和生物膜的形成，是口腔疾病发病的重要原因之一，通过常规手段难以根治。近年来，龋病、牙周病等口腔疾病发病率逐年上升。牙齿修复或正畸治疗后带来的菌群失调等口腔问题也日益突出[1]，而常见的口腔疾病的发生与口腔致病菌的定植扩散有着密切的关联。变异链球菌和戈氏链球菌是主要致病菌，它们通过分泌黏附素初步黏附在牙齿表面[2]，形成生物膜，进而通过产酸和其他代谢物损伤牙体及其周围组织，从而诱发龋齿等口腔疾病[3]。目前控制口腔疾病的主要方法有机械去除法和抗菌药物的应用。然而，生物膜对抗菌药物有很强的抵抗力，机械去除法有效但很难长期维持[4]。

乳酸菌在口腔中的黏附定植是抑制口腔致病菌黏附的有效措施。黏附和聚集能力是在开发新菌株的关键。唾液链球菌是一种非致病性和数量上占优势的口腔种类，是开发口腔模型益生菌的理想候选者[5]。唾液链球菌K12非常适合用作口腔益生菌，因为其天然倾向于居住在人类口腔中并且与许多适应性相同的口腔病原体具有强烈竞争力[6]。已有研究表明产生细菌素的K12对引起口臭的细菌具有明显抗菌活性[7]。此外，Moon等的体外抑菌试验中发现益生菌K12对引起口腔疾病的口腔细菌在一定浓度范围内表现了显著的抑菌活性[8]。副干酪乳杆菌是对变形链球菌具有最大干扰能力的物种之一[9]，已有研究表明副干酪乳杆菌F19对5种变形链球菌菌株均有抑制作用[10]。一项临床医学研究表明口服副干酪乳杆菌GMNL-33两周后唾液中的变异链球菌被显著抑制[11]。但是，目前国内尚未有关于副干酪乳杆菌抑制口腔致病菌的研究。

关于益生菌对口腔致病菌的抑制，国内常见的研究方法主要是牛津杯法测定抑菌圈[12]，但该法并不能模拟真实口腔环境。在已有文献中用到的几种黏附介质唾液包被的微量滴定板[13]、有机溶剂[14]、口腔上皮细胞[15]等，与牙齿的成分似乎相差甚远，唾液包被的羟磷灰石珠子[16]和羟磷灰石圆盘[17]是体外研究龋齿防治的最佳选择，唾液包被的羟磷灰石模型能较高水平模拟口腔牙齿环境。已有研究中对于变异链球菌黏附量的测定，常用的方法有平板计数法[18]和35 S-甲硫氨酸代谢标记计数法[19]。但是平板计数仅限于检测活细菌数量，标记法也局限于它对细菌的标记效率。而实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一套能够快速、准确鉴别细菌的鉴定方法。

副干酪乳杆菌L9是一株从长寿老人粪便中分离得到的益生菌株，已有试验证明该菌株具有较高的安全性[20]。目前对于L9的研究主要集中于肠道益生功能[21]。本试验通过构建口腔细菌的体外黏附模型，建立实时荧光定量PCR特异性检测致病菌的方法，以唾液链球菌K12作为阳性对照，评估副干酪乳杆菌L9对口腔中主要致病菌（变异链球菌和戈氏链球菌）的抑制黏附作用。本研究将为副干酪乳杆菌在口腔疾病预防领域的应用提供直接的理论证据和支持；也将为益生菌口腔护理产品的开发提供一定的应用指导和菌种资源。

1 材料与方法

1.1 菌株培养

本试验中选用了两株致病菌分别为戈氏链球菌1.2496（Streptococcus gordonii1.2496，S.gordonii）、变异链球菌 1.2499（Streptococcus mutans1.2499，S.mutans）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，使用BHI培养基进行培养，两株益生菌分别为副干酪乳杆菌L9（Lactobacillus paracasei L9，L9）和唾液链球菌K12（Streptococcus salivarius，K12），其中副干酪乳杆菌L9分离自广西巴马长寿老人肠道，使用MRS培养基进行培养，唾液链球菌K12购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，使用M17培养基进行培养。以上所有菌株均以20%脱脂乳形式保存于-20℃，取200 μL于相应培养基在37℃恒温培养箱中培养12 h，并传代。

1.2 材料与试剂

羟基磷灰石（80 μL）：日本 Bio-Rad Laboratories公司；羟磷灰石圆盘（5 mm×2 mm）：美国 Clarkson Chromatography公司；细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：天根生化科技有限公司；SYBRGREEN 1染料：宝日医生物技术公司；细菌存活率染色试剂盒：赛默飞世尔科技公司；溶菌酶（＞20 000 U/mg）：生工生物工程有限公司；牛血清蛋白：科奥科技有限公司。

1.3 仪器与设备

Light CyclerR96Real-Time PCR仪：瑞士罗氏公司；A1RMP共聚焦扫描显微镜：尼康映像仪器销售有限公司；Infinite M200PRO酶标仪：瑞士Tecan公司；pH211酸度计：意大利哈纳科仪公司；3K3O低温高速离心机：德国Satorious公司；DK-8B电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；JY-ECP3000电泳仪：河南兄弟设备有限公司；Mini SC电泳槽：北京凯元信瑞仪器有限公司；Bioscreen C全自动生长曲线仪：百奥斯科林公司；MCO-12AC CO2培养箱：日本Sanyo公司。

1.4 方法

1.4.1 致病菌特异性引物筛选及标准曲线制作

通过查找文献获得6对变异链球菌引物，引物信息如表1、2所示，通过定量PCR筛选出能够特异性扩增变异链球菌和戈氏链球菌，但不能扩增唾液链球菌和副干酪乳杆菌的特异性引物。

表1 致病菌引物表[22-25]Table 1 The table of specific primers for pathogenic bacteria

表2 引物反应体系及反应条件[22-25]Table 2 Reaction system and reaction conditions of primers

使用特异性引物对致病菌进行定量PCR，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并使用胶回收试剂盒回收DNA，测定标准DNA浓度并进行10倍梯度稀释8次，以此作为模板进行定量PCR，最后以各梯度稀释液中DNA的拷贝数浓度的对数为横坐标，以扩增循环数Ct值为纵坐标，制作标准曲线。

1.4.2 唾液预处理

唾液收集，选择10名24岁～40岁的健康志愿者，收集唾液。健康成人在进食2 h后用清水漱口，利用唾液收集管收集无刺激性唾液（口含棉棒10 min），低温高速离心机4℃5 500 r/min离心15min，取上清液，以0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，收集的唾液部分与0.1 mol/L的氯化钾缓冲液1∶1等体积混合，用于羟磷灰石模型，部分与PBS 1∶1等体积混合用于生物膜形成。均保存于-20℃备用，长期存放于-80℃。志愿者要求如下[26]：

无吸烟历史，在收集前1 h内没有进食、饮水、饮酒等；没有正在生病、没有正在服用药物，尤其1个月内未服用抗生素类药物；3 d内未食用酸奶、益生菌饮料；无龋病、牙周病等口腔疾患。

1.4.3 羟基磷灰石模型黏附试验

操作如图1所示，准确称量10 mg羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）珠子于24孔培养板中，每孔加入200 μL 氯化钾缓冲液（50.0 mmol/L KCl，0.35 mmol/L K2HPO4，0.65mmol/LKH2PO4，1.0mmol/LCaCl2，0.1mmol/L MgCl2，pH6.5）中浸泡过夜，次日吸去缓冲液加入100μL已处理好的唾液，室温下6 r/min旋转1 h后吸去唾液，200 μL缓冲液洗涤两次并吸干缓冲液，加入100 μL含5mg/mL牛血清蛋白的氯化钾缓冲液，室温下6 r/min旋转30 min后吸干，氯化钾缓冲液洗涤2次，即制成唾液包被的羟磷灰石模型。

传代的第二代菌室温2 500 r/min离心15 min，收集细菌，氯化钾缓冲液洗菌两次，悬浮于含有5 mg/mL牛血清蛋白的氯化钾缓冲液中，制成菌浓度为107cfu/mL的菌悬液备用。将试验分为两组预防组和治疗组：预防组为加入益生菌悬浮液125 μL旋转作用1 h后加入致病菌悬浮液125 μL；治疗组为加入致病菌悬浮液125 μL旋转作用1 h后加入益生菌悬浮液125 μL；空白对照组则用含5 mg/mL牛血清蛋白的氯化钾缓冲液代替益生菌悬浮液。室温6 r/min旋转2、6、18 h，氯化钾缓冲液洗涤2次，收集羟磷灰石珠子进行定量PCR，收集缓冲液测定pH值，每组3次重复。

图1 试验流程图Fig.1 Schematic diagram of the experiment process

1.4.4 共聚焦激光显微镜检测生物膜

基于以上羟磷灰石黏附模型的研究结果，进行L9、K12抑制变异链球菌生物膜形成的试验。方法如图1所示，细菌在37℃接种两代至生长对数期4 500 r/min离心 10 min弃上清，PBS（4℃，4 500 r/min，10 min）洗涤2次，悬浮于含有质量分数为0.2%的蔗糖的人造唾液培养基[27]中，制成菌浓度为107cfu/mL的菌悬液备用。高压灭菌的圆盘置于24孔组织培养板的孔中（每孔中一个圆盘，圆盘不可接触孔壁），37℃用上述唾液（1.5 mL/孔）包衣4 h，1.5 mL PBS冲洗2次。加入细菌悬浮液各750 μL，在羟磷灰石圆盘表面培养24 h形成生物膜。

将圆盘依次用1.5 mL无菌PBS（每次漂洗的浸泡时间，10 s）冲洗3次，以除去非黏附细菌；使用安装在无振动平台上的488 nm Ar/Ar-Kr激光扫描头的TCS SP2共聚焦显微镜进行非侵入式共聚焦成像。使用的物镜是20×，图像三倍放大；样本进行LIVE/DEAD染色使用RBacLightTM细菌活力试剂盒。染色时间为（9±1）min，染色比例为 1∶1，获得在相应波长[Syto9：515nm ～530 nm ；碘化丙啶（PI）：＞ 600 nm]下的最佳荧光信号；选择覆盖有生物膜的圆盘上至少3个独立且具有代表性的位置进行这些测量（基于在共聚焦视场中标识的堆叠或“塔”）。在每个区域内，通过确定生物膜的上限和下限来测量最厚的点。CLSM软件被设置为采用1 μm 厚度的 z系列扫描（xyz）（8位，1 024× 1 024像素）。为了量化生物膜内的生物量和细胞生存力，使用NIS Viewer软件程序进行分析共聚焦显微照片。手动设置每种荧光颜色的荧光强度阈值[28]。

1.5 数据处理

所有试验结果均表示为均值±方差，每组试验3个平行进行3次重复，使用EXCEL软件处理数据作图，使用23.0版SPSS软件进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 变异链球菌和戈式链球菌定量检测方法的建立

2.1.1 特异性引物筛选

针对6对引物，通过筛选并验证得到1对引物B2能对变异链球菌和戈氏链球菌进行特异性扩增，电泳图如图2所示，变异链球菌和戈氏链球菌在200 bp附近有条带，其他均无条带出现。

图2 引物B2扩增产物电泳图Fig.2 Electropherogram of the amplified product of the primer B2

图3 B2引物对4株菌的扩增曲线和溶解曲线Fig.3 Amplification curve and dissolution curve of 4 strains amplified by the primer B2

用B2引物对4株菌的扩增曲线和溶解曲线如图3，其中图3（a）中扩增曲线3和4的Ct值均大于30，认为该引物不能扩增出副干酪乳杆菌L9和唾液链球菌K12。因此，应用筛选得到的引物B2能对致病菌益生菌混合体系中的致病菌含量进行特异性检测。

2.1.2 标准曲线建立

以引物B2定量扩增变异链球菌和戈氏链球菌得到的标准曲线如图4所示。变异链球菌扩增标准曲线为y=-3.558 1x+58.998，R2=0.998 2；戈氏链球菌扩增标准曲线为y=-3.693x+60.528，R2=0.997 7。可用于变异链球菌和戈氏链球菌的定量检测。

2.2 L9对致病菌的抑制黏附效果

图4 戈氏链球菌、变异链球菌Ct值与DNA浓度对数值的线性关系Fig.4 Linear relationship between the logarithm of DNA concentration and the Ct value of S.gordonii and S.mutans

预防组结果如图5（a）和（b），加入两株益生菌与戈氏链球菌相互作用2、6、18h后，戈氏链球菌含量与不加益生菌的对照组相比显著降低（p＜0.05），充分证明了K12和L9对戈氏链球菌均具有显著预防黏附作用。在相互作用2h时，与阳性对照K12组（3.04×109cfu/mL）相比，L9对戈式链球菌的抑制作用显著高于k12（p＜0.05），戈氏链球菌降低到了2.05×109cfu/mL。而在6 h时L9组戈氏链球菌黏附量（2.63×109cfu/mL）显著高于K12组（1.51×109cfu/mL），18 h两组益生菌组的抑制黏附作用无显著性差异（p＞0.05）；对于变异链球菌，与对照组相比，两株益生菌在加入2 h和6 h后，变异链球菌含量均显著降低（p＜0.05），黏附2 h时K12组和L9组分别降低了 0.36×109cfu/mL和0.93×109cfu/mL，6 h分别降低了 2.76×109cfu/mL 和 1.49×109cfu/mL，两株菌对变异链球菌的抑制作用差异不显著（p＞0.05），作用18h后，K12组的变异链球菌含量与对照组无显著性差异（p＞0.05），而加入L9的试验组中变异链球菌的含量（2.46×109cfu/mL）显著低于对照组（4.26×109cfu/mL）和 K12 组（4.09×109cfu/mL）（p＜0.05）。

图5 致病菌浓度随黏附时间的变化Fig.5 Changes in concentration of pathogenic bacteria with adhesion time

A.Hankioja等的研究发现加入益生菌后变异链球菌计数显著减少，而戈氏链球菌反而受到较小的影响[29]。这一结果在本试验治疗组中有同样体现。治疗组如图 5（c）、（d）中，对照组与益生菌 L9 和 K12 组的结果均无显著性差异（p＞0.05）；而对于变异链球菌，K12对其抑制不显著（p＞0.05），反而L9在作用2h后显著抑制了变异链球菌的含量（p＞0.05）。我们推测产生这种差异的原因可能是由于不同益生菌在唾液中的结合位点是有差异的，从而对致病菌黏附产生不一样的抑制效果。

本试验结果显示无论是变异链球菌还是戈氏链球菌，预防黏附的效果均优于治疗黏附的效果。相对于简单的细菌体外共培养试验[30]，本试验模拟预防和治疗的设计更具有实际意义。加入益生菌的先后影响了致病菌的黏附，该结果表明益生菌在口腔中起到的抑制作用并非是简单的非特异性空间位阻[31-33]，而很可能是益生菌能够与致病菌竞争性结合唾液获得性膜上的蛋白受体，从而减少致病菌的黏附量。当然，益生菌的具体黏附机制和竞争受体的特异性仍需进一步研究证明。

2.3 pH值测定结果

由于乳酸杆菌是产酸性和酸性细菌，它们与口腔疾病密切相关[34-36]。本研究测定了两株益生菌菌在黏附过程中对缓冲液 pH 值的影响，图 6（a）、（b）结果显示在预防戈氏链球菌组中，在0 h益生菌组缓冲液pH值均显著高于0 h的对照组（p＜0.05），18 h后三组间无显著性差异（p＞0.05）；预防变异链球菌组中0 h和18 h均无显著差异。而在治疗组图6（c）、（d）中，与变异链球菌和戈氏链球菌对照组相比，唾液链球菌K12组pH值均显著降低（p＜0.05），黏附培养18 h后，L9组pH值显著低于对照组（p＜0.05）。该结果说明L9和K12预防致病菌黏附的过程中不会增加产酸，这可能与其抑制致病菌的定植和乳酸释放有关[37]。而在治疗过程中，它们可能有酸化口腔环境的不良作用，唾液链球菌K12酸化作用更严重。

图6 缓冲液pH值的变化Fig.6 Changes in pH value

图7 羟磷灰石圆盘形成生物膜厚度及其示意图Fig.7 Thickness and Schematic diagram of the biofilm formed on the hydroxyapatite disc

2.4 激光共聚焦检测生物膜结果

成熟的牙菌斑生物膜是导致口腔疾病发生的主要因素，从图7（a）中可以看出，与对照组相比，益生菌组（L9和K12）在羟磷灰石表面形成的生物膜厚度均显著降低（p＜0.05），且K12与L9组的生物膜厚度没有显著性差异。对照组的平均厚度为16.33 μm，L9和K12组平均厚度分别为12.63 μm和13.13 μm。图7（b）、（c）、（d）显示对照组细菌生物膜密度明显高于其他试验组，细菌密集成大片云状，层层叠叠，比较聚集。而加入L9和K12的试验组细菌菌落较分散，暗黑的空隙范围很大，细菌分布零乱，尤其是L9组细菌呈现零星点状，比K12组形成的细菌密度更小。因此，副干酪乳杆菌L9和唾液链球菌K12能够通过抑制变异链球菌的黏附，减少牙菌斑生物膜的产生，从而预防口腔疾病的发生。

3 结论

综上所述，本研究证明了副干酪乳杆菌L9能够在不影响环境酸度的前提下预防变异链球菌和戈氏链球菌对羟基磷灰石珠子的黏附，能够显著降低致病菌在载体表面形成的生物膜量，且总体来看，L9抑制致病菌黏附效果优于阳性对照K12组，且致酸性弱。因此，副干酪乳杆菌L9可以作为一种预防口腔致病菌的潜在手段，但这种抑制机制和临床防治效果仍需深入探究。