超高压耦合酶解鳕鱼骨的工艺优化 及其对酶解液滋味的影响

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(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工 及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.荣成泰祥食品股份有限公司,山东威海 264300)

狭鳕鱼(Pollock,Theragrachalcogramma)俗称明太鱼或朝鲜明太鱼,属脊椎动物门(Vertebrata)鳕形目(Gadiformes)[1],是重要的经济鱼类,广泛分布于太平洋北部。鳕鱼作为我国远洋捕捞的重要鱼种之一,年加工量可达50万吨[2]。鳕鱼骨是鳕鱼加工过程中产生的主要副产物之一,骨间仍残留大量的鱼肉,约占鱼体总重的15%[3]。传统的处理方法是加工成鱼粉或动物饲料,目前国内关于鳕鱼下脚料的加工主要为集中利用双酶复合水解制取鱼蛋白、水解制备美拉德反应产物和酶解制备明胶多肽螯合钙等[4-6],但上述方法均存在酶解效率低下、酶耗量较高的问题。

超高压技术是一种通过给蛋白质体系提供一定的压力,改变蛋白质结构,从而提高蛋白质原本生物学功能的物理改性方法[7-8]。超高压能使蛋白质适当变性利于酶解[9-10],另有研究表明,超高压还会改善酶解液的风味[11]。本文以鳕鱼加工副产物鳕鱼骨为研究对象,采用超高压耦合酶解技术,通过单因素实验和正交试验优化鳕鱼骨高压酶解工艺,以期通过超高压耦合处理提高酶解效率,改善酶解效果,旨在为超高压耦合酶解技术在水产品加工副产物中的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鳕鱼骨 大连天宝绿色食品股份有限公司;碱性蛋白酶(2.4 AU-A/g)、风味蛋白酶(500 LAPU/g) 丹麦Novozymes公司;福林酚、三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)、甲醛、标准氢氧化钠溶液(0.05 mol/L) 分析纯,北京市索莱宝科技有限公司;酪氨酸标准品 北京市索莱宝科技有限公司。

HPP.L2-600/0.6型超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司;LY-380D隆粤商用多功能破壁料理机 中山市隆粤电器厂;HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;Biofuge stratos台式冷冻高速离心机 美国Thermo Fisher公司;Orion Star系列手持式便携pH计 美国Orion公司;Thermo公司全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鳕鱼骨的酶解工艺流程 参考Hou等[2]的方法,鳕鱼骨解冻、清洗后加水粉碎,至没有明显大颗粒(粒径<0.5 cm),取300 g进行试验,料水质量比1∶1,调节pH,加入0.3%鱼骨质量的碱性蛋白酶和0.1%鱼骨质量的风味蛋白酶,55 ℃常压酶解3 h或在一定超高压下条件下酶解一定时间后,转入常压酶解至3 h,95 ℃灭酶15 min过滤(200目滤网),3500 r/min离心20 min,取上清液分装于蒸煮袋中,于-80 ℃条件下冷冻以备检测。

1.2.2 单因素实验 取5份粉碎后的鳕鱼骨(每份300 g),参照上述酶解工艺,选取酶解压力、酶解时间、酶解pH这三个因素进行单因素实验,以氨基酸态氮含量作为酶解液的评价指标。

1.2.2.1 压力对酶解效果的影响 压力分别设为50、100、150、200、250 MPa,其它固定条件为:pH7.5,超高压时间60 min,料水比1∶1,酶解温度55 ℃。

1.2.2.2 酶解时间对酶解效果的影响 酶解时间分别设为20、40、60、80、100 min,其它恒定条件为:pH7.5,压力100 MPa,料水比1∶1,酶解温度55 ℃。

1.2.2.3 pH对酶解效果的影响 分别调节pH至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,其它恒定条件为:压力100 MPa,酶解时间60 min,料水比1∶1,酶解温度55 ℃。

1.2.3 正交试验 基于单因素实验结果,以酶解液中的氨基酸态氮含量为指标,选择酶解压力、酶解时间、酶解pH三个因素,进行L9(34)正交试验,确定超高压耦合酶解鳕鱼骨的最佳工艺条件,因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 可溶性肽含量的测定 标准曲线的绘制:配制浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/mL的酪氨酸溶液,分别取1 mL(做三个平行)于不同的试管中,加入5 mL福林酚试剂甲,混匀后在20～25 ℃下放置10 min,再加入0.5 mL福林酚试剂乙,立即摇匀,在20～25 ℃保温30 min,然后在波长500 nm处测定光密度值,取三组测定的平均值,吸光度为横坐标,以可溶性肽浓度为纵坐标,绘制标准曲线。

样品测定:采用TCA沉淀法对样品进行前处理。具体操作为:将3 mL的样液加入至27 mL质量分数为5%的TCA,均质后于4 ℃下放置1 h,5 000 r/min离心10 min,得上清液。然后用超纯水稀释至合适浓度使可溶性肽的浓度控制在0.2～0.25 μg/mL范围之内。取1 mL稀释液加入5 mL福林酚试剂甲混匀后在20～25 ℃下放置10 min,再加入0.5 mL福林酚试剂乙,立即摇匀,在20～25 ℃保温30 min,然后在波长500 nm处测定光密度值。空白对照:另取3 mL纯水加入至27 mL质量分数为5%的TCA,以下操作同样品测定。

1.2.5 氨基酸态氮和氨基酸含量的测定 参考姜绍通等[12]的方法,采用甲醛滴定法对酶解液进行氨基酸态氮含量的测定。

氨基酸含量采用氨基酸自动分析仪进行测定。分别统计总游离氨基酸(total free amino acids,TFAA)、必需氨基酸(essential amino acids,EAA)、非必需氨基酸(nonessential amino acids,NEAA)和呈味氨基酸(delicious amino acids,DAA)的含量。DAA及TAV分析:滋味有酸、甜、苦、咸和鲜5种基本味觉,DAA含量对呈味起着至关重要的作用。TAV表示各个呈味物质的含量与其阈值的比,当TAV大于1时,认为该物质对呈味有贡献,而TAV小于1时认为该物质对呈味没有贡献[13],由此可以确定主要呈味的氨基酸。

1.2.6 感官评价 感官评定小组由10人(5男5女)经专业培训后组成,对酶解液进行描述性感官鉴评,描述统计其风味,具体评价标准见表2[14]。

表2 酶解液感官评价标准Table 2 Evaluation criteria of sensory of hydrolysates

1.3 数据处理

每组试验重复3次,结果以“Mean±SD”表示,采用SPSS 19.0(美国IBM公司)统计软件进行数据处理和方差分析,采用多重比较分析法对各处理组进行显著性分析,p<0.05为差异显著,p<0.01为差异极显著。采用Origin Pro 9.1(美国OriginLab公司)进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 压力对酶解液氨基酸态氮的影响 由图1可知,超高压压力由50 MPa增加到250 MPa的过程中,氨基酸态氮含量呈现先增加后减少的趋势,不同压力条件下(100～200 MPa)氨基酸态氮含量的变化差异极显著(p<0.01)。在超高压压力为100 MPa时,氨基酸态氮含量达到最高,为0.360 g/100 mL。较低的压力对酶活中心具有凝聚作用,在50 MPa加压到100 MPa过程中,酶的活性中心逐渐被激活。Maria等[15]亦研究发现,随着压力增大,蛋白质结构伸展,水解度增加;而当压力超过400 MPa时,蛋白质发生聚集,水解度下降。在本研究中,压力超过100 MPa后,氨基酸含量发生下降,这可能是超高压作用使酶的活性中心的氨基酸组成发生改变或逐渐丧失活性中心,从而改变酶的催化活性,使水解度下降[16]。因此,选择100 MPa为最适超高压压力。

图1 压力对酶解液中氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of pressure on the content of amino-acid nitrogen in hydrolysates注:不同字母代表差异极显著(p<0.01),图2～图3同。

2.1.2 酶解时间对酶解液氨基酸态氮的影响 由图2可知,酶解时间从20 min增加到100 min的过程中,氨基酸态氮含量呈现先增加后降低的趋势,不同时间条件下氨基酸态氮含量的变化差异极显著(p<0.01)。酶解时间过短,会使酶活性中心激活不完全,在酶解时间增加至60 min过程中,随着酶活性中心逐渐被激活,氨基酸态氮含量逐渐增加,至60 min氨基酸态氮含量达到最大值,为0.372 g/100 mL。谢丹丹等[17]研究发现,200 MPa条件下,随着酶解时间的延长,木瓜蛋白酶的活性先增加后降低,随着酶解时间的继续增加,长时间的超高压处理导致酶活降低,从而使得酶解效率降低。因此,本研究选择60 min为最适酶解时间。

图2 酶解时间对酶解液中氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of enzymolysistime on amino-acid nitrogen of hydrolysates

2.1.3 pH对酶解液氨基酸态氮的影响 大部分酶制剂对pH较敏感,pH能够影响酶分子活性部位有关基团和底物的解离,使底物不适于与酶结合或两者的结合力降低,从而影响酶解反应的速度。由图3可知,超高压酶解在pH从6.5增加到8.5的过程中,氨基酸态氮含量呈现先增加后降低的趋势,不同酶解pH条件下氨基酸态氮含量的变化差异极显著(p<0.01)。在pH为8时,氨基酸态氮含量达到最大值,为0.378 g/100 mL。因此选择最适pH为8。

图3 pH对酶解液中氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of pH on amino-acid nitrogen of hydrolysates

2.2 正交试验结果

超高压耦合酶解鳕鱼骨的正交试验结果见表3。由表3可知,影响超高压耦合酶解效果的因素主次顺序依次为:B>C>A,即酶解时间>pH>压力。比较均值k大小可以得出超高压耦合酶解鳕鱼骨的最佳组合A3B2C2,即压力150 MPa、酶解时间60 min、pH7.5。在最优条件下进行3次验证试验,测得氨基酸态氮的含量达到(0.380±0.04)g/100 mL,优于各个正交试验组,而常压酶解所得的酶解液中氨基酸态氮的含量是0.226 g/100 mL,超高压酶解液中的氨基酸态氮含量是常压酶解液中氨基酸态氮含量的1.68倍,说明超高压处理作为一种辅助酶解的手段,有效提高了酶解液中的氨基酸态氮含量,促进了酶解效率。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4为正交试验方差分析,由表4可知,以氨基酸态氮含量为指标影响超高压耦合酶解的主次顺序为酶解时间>pH>压力,方差分析和极差分析结果一致。

表4 正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

2.3 超高压耦合酶解鳕鱼骨酶解液的感官评价结果

对最优组合超高压耦合酶解液和常压酶解液的感官进行评价,如图4所示。超高压耦合酶解液的腥味、苦味和涩味均弱于常压酶解液,鲜味强于常压酶解液,说明超高压耦合酶解处理改善了酶解液的风味。

图4 酶解液感官评价雷达图Fig.4 Radar map of enzymatic hydrolysis sensory evaluation

2.4 超高压耦合酶解鳕鱼骨酶解液中可溶性肽的含量

肽是由蛋白质大分子降解得到的,因此,酶解液中可溶性肽含量的高低反映了酶解效率的大小。从营养学角度来说,肽类比同一氨基酸组成蛋白质的消化吸收率要高,且风味优于单个氨基酸,有的肽还具有特征性的滋味,且不易导致过敏现象。超高压耦合酶解液和常压酶解液中的可溶性肽含量如图5所示。由图5可知,超高压耦合酶解液中可溶性肽的含量显著(p<0.05)大于常压酶解,是常压酶解液中可溶性肽含量的1.47倍,该结果和邵懿等[18]的研究结果一致。蛋白质的二级结构是由肽链内和肽链间的氢键来维持,而超高压的作用有利于氢键的形成。因此,超高压处理有利于二级结构的稳定,但会破坏其三四级结构,其疏水及离子结合会因体积的缩小而被切断,导致蛋白质结构伸展,暴露出更多的催化活性位点,所以超高压处理酶解液中的多肽含量高于常压酶解。

图5 酶解液可溶性肽含量Fig.5 Soluble peptide of hydrolysates注:不同字母代表差异显著(p<0.05)。

2.5 超高压耦合酶解鳕鱼骨酶解液的游离氨基酸组成及含量

由表5可以看出,常压酶解液中TFAA含量为(5539.1±7.6) mg/100 mL,而超高压耦合酶解液中TFAA含量为(6240.4±8.1) mg/100 mL,为常压酶解液的1.13倍,该结果与Yoshino等[21]的研究一致,该研究团队发现,相同酶解条件下鱼肉经100 MPa超高压处理酶解后游离氨基酸含量普遍高于常压(0.1 MPa)酶解。超高压处理使得酶结构发生改变,致使更多的活性位点暴露,激活了酶的催化效应,产生了更多的游离氨基酸,因此适当压力条件下,超高压耦合酶解对酶解效果有促进作用,该实验结果与Northrop[22]和励建荣[10]等报道的结论一致。

表5 酶解液游离氨基酸组成、呈味特性及TAV值Table 5 Free amino acid composition,flavor characteristics and TAV of hydrolysates

常压酶解液和超高压耦合酶解液中均含有17种游离氨基酸,其中以谷氨酸含量最高(分别占TFAA含量的14.27%和14.60%),其次为脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸。常压酶解液和中超高压耦合酶解液EAA占TFAA含量的分别为32.68%和33.38%,DAA占TFAA的含量分别为97.81%和98.02%。由此可见,超高压耦合酶解具有提高酶解产物中的必需氨基酸和呈味氨基酸含量的趋势。游离氨基酸分鲜、甜和苦3类[23],表5中苦味氨基酸9种,鲜味2种,甜味5种。DAA的TAV值越大,呈味作用越显著,对滋味的贡献越大[24]。常压酶解液和超高压耦合酶解液中,除苏氨酸外的每种DAA的TAV均大于1,对样品整体滋味的形成具有一定的贡献。谷氨酸鲜味最强,是重要的鲜味剂,其在常压酶解液和超高压耦合酶解液中TAV最大,分别为26.3和30.4,对滋味的贡献度最大。甜味氨基酸和鲜味氨基酸作为良好呈味基料的基础,可以呈现良好的滋味[25,26]。此外,TAV较高的还有组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、甘氨酸、精氨酸、天门冬氨酸,其中天门冬氨酸为鲜味氨基酸,丙氨酸、甘氨酸为甜味氨基酸,其余6种为呈苦味氨基酸。由此可见,在超高压耦合酶解下,谷氨酸的TAV值增长明显,对酶解液的滋味具有更大贡献。

3 结论

本研究采用超高压耦合酶解技术,通过单因素实验和正交试验优化鳕鱼骨高压酶解工艺,探讨了超高压耦合酶解对酶解液的氨基酸态氮、感官评价、可溶性肽、游离氨基酸等指标的影响。结果表明,在pH7.5、150 MPa条件下加压处理60 min的最优条件下,氨基酸态氮的含量达到(0.380±0.04) g/100 mL,提高了1.68倍;感官评价表明,超高压耦合降低了酶解液的腥味、苦味和涩味,增强了酶解液的鲜味,酶解液风味得到改善;可溶性肽含量提高了1.47倍;游离氨基酸总量达到(6240.4±8.1) mg/100 mL,是常压酶解液的1.13倍;谷氨酸的TVA值最大,对酶解液的滋味贡献最大。超高压耦合酶解提高了鳕鱼骨的酶解效率,改善了酶解产物风味,具有提高酶解产物中的必须氨基酸和呈味氨基酸含量的趋势。本研究为超高压耦合酶解技术在水产品加工副产物中的应用提供了理论依据。