云南葡萄酒产区酵母多样性 及特色菌种酿酒应用研究进展

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(云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心,云南昆明 650201)

酵母菌的分布与地理位置和气候条件等密切相关。目前,世界上许多著名葡萄酒产地的本土酵母菌已经被广泛研究[1]。而我国各主要葡萄酒产区酵母种群的分布也已引起研究人员的极大关注[2-4]。其中,以山东[5]、河北[6]、宁夏[7]、甘肃[8]和新疆[9]等产区居多。云南省地处我国西南边陲,北依欧亚大陆,南濒热带海洋,西与青藏高原相连,地势高差悬殊,同时又受到高原季风的影响,因此具有丰富的气候类型[10],这为优质酵母种质资源的研究和开发提供了优越条件。

在葡萄酒酿造过程中,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在将葡萄汁中的糖转化为乙醇、二氧化碳以及其他风味物质(甘油、杂醇、醛类、酸类和酯类等)的过程中具有重要作用。然而,参与这一过程除酿酒酵母之外还有非酿酒酵母(Non-Saccharomyces),它们存在于葡萄园土壤、葡萄表皮与酿酒过程中,参与葡萄酒酿造,对葡萄酒风味具有重要影响[11]。与酿酒酵母相比,一些非酿酒酵母具有明显的优势,如富产酯[12]、富产甘油[13]、较低的乙醇转化率[13]和产生多种酶类(果胶酶、糖苷酶[14]、脂肪酶[15]和蛋白酶[16])等。但也有一些非酿酒酵母可能会代谢产生不良风味物质(硫化氢、醋酸和挥发性酚等)和造成酒体浑浊。因此,为了降低风险,大多数酿酒师会倾向使用商业酵母。虽然采用商业酵母发酵使葡萄酒的品质更有保障,但也造成产品同质化的问题。如果能充分利用非酿酒酵母的优势,使其在受控的条件下参与或辅助葡萄酒酿造,酿造出的葡萄酒将会具有独特风格和地域特色[17]。

本文对云南葡萄酒产区酵母多样性及特色菌种酿酒应用研究进行综述,以期对本土葡萄酒酵母资源的开发及特色葡萄酒的生产提供参考。

1 云南主要葡萄酒产区分布

1.1 弥勒产区

弥勒产区位于云南省东南部红河州弥勒县(图1),该产区海拔相对较低(约为1375～1519 M),无霜期长,光热充足,为典型亚热带干热河谷气候[18-19]。酿酒葡萄主要栽培品种有玫瑰蜜、水晶、赤霞珠、烟73和法国野等,新品种“云中舞”是云南高原葡萄酒有限公司精选出的适合当地栽培的优质酿酒葡萄品种。得天独厚的土壤和气候条件造就了弥勒葡萄产区葡萄成熟早、色泽艳和香味浓的特点,而所酿之酒更是具有丰满的酒体和独特的水果芳香。

1.2 丘北产区

丘北产区位于云南省东南部文山州丘北县(图1),该产区葡萄种植区为丘陵地带[18]。葡萄生长期降雨量较大,成熟期降雨量减少,日照充足,昼夜温差大,葡萄整体糖度较高。这里独特的气候与土壤造就了当地酿酒葡萄及葡萄酒的与众不同。酿酒葡萄主要栽培品种有赤霞珠、法国野和烟73等。

1.3 香格里拉产区

香格里拉产区位于云南省迪庆州(图1),其葡萄种植区主要位于德钦县澜沧江和金沙江河谷地带。该产区海拔较高且跨度较大(约为1900～2900 m),具有丰富的小气候,总体气候干燥,年降雨量仅400～600 mm,昼夜温差大,葡萄糖度高、着色好、病害少,非常适合高质量葡萄酒,特别是冰葡萄酒的酿造[18]。酿酒葡萄主要栽培品种为赤霞珠。

图1 云南主要葡萄酒产区分布图Fig.1 Distribution map of main wine producing regions in Yunnan

2 云南产区葡萄酒酵母多样性的研究

早在2002年,李绍兰等[20-21]就分别对云南省西双版纳热带雨林和德钦白马雪山自然保护区中酵母菌的种属和分布进行了研究,在西双版纳热带雨林分离得到酵母菌584株,经分类鉴定为12个属:隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、丝孢酵母属(Trichosporon)、酵母属(Saccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、地霉属(Geotrichum)、毕赤酵母属(Pichia)、锁掷孢酵母属(Sporidiobolus)和拟威尔酵母属(Williopsis);在德钦白马雪山自然保护区分离得到酵母菌224株,经分类鉴定为8个属:德巴利酵母属(Debaryomyces)、掷孢酵母属(Sporidiobolus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、假丝酵母属(Candida)、裂芽酵母属(Schizoblastosporion)、红酵母属(Rhodotorula)和丝孢酵母属(Trichosporon)。通过与云南紫金山和鸡足山的酵母菌比较发现,其优势种均为隐球酵母属(Cryptococcus)。虽然该研究所使用试验材料并没有涉及葡萄或葡萄酒,但还是可以看出云南省蕴含着丰富的酵母种质资源,为今后的研究奠定了基础。

关于云南葡萄酒产区酵母相关的研究始于孙卉卉等[22]对云南弥勒产区水晶葡萄醪中酵母菌的多样性研究。该研究共分离得到代表性酵母菌82株,对这些代表性酵母菌分类结果表明,这些酵母菌可归为4个属6个种,即葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、叉开假丝酵母(Candidadiversa)、一种耐寒耐渗透性的假丝酵母(Candidazemplinina)、星形假丝酵母(Candidastellata)、西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)和浅黄隐球酵母(Cryptococcusflavescens)。可能受自然发酵前二氧化硫处理和葡萄品种的影响,该研究并没有分离到如梅奇酵母(Metschnikowia)、毕赤酵母(Pichia)、克鲁维酵母(kluyveryces)、有孢圆酵母(Torulaspora)和酿酒酵母(Saccharomyces)等在其他类似研究中出现的酵母。

随后,刘小珍等[23]又从云南昆明官渡区葡萄果皮上分离得到酵母菌207株,通过ITS(Internal Transcribed Spacer)序列分析表明,在昆明的葡萄园中分离得到了3个属5个种的酵母,包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、胶红酵母(Rhodotorulamucilagionsa)、金佩梅奇酵母(Metschnikowiachrysoperlae)、美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)和核果梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)。此外,该研究还利用SSR(Simple Sequence Repeats)对分离得到的酿酒酵母进行分析,发现分离得到的23株酿酒酵母为4个不同菌株。通过与国际酿酒酵母指纹图谱库序列比对,发现其中1株酿酒酵母菌株与欧洲商用菌株X5的指纹图谱完全一致,而其他3个菌株则未匹配到亲缘关系明显较近的菌株,表明在昆明的葡萄园中可能栖息着具有独特遗传特征的酿酒酵母。

随着对云南香格里拉产区葡萄与葡萄酒研究的开展与深入,该产区葡萄酒相关酵母的研究与开发也逐渐受到国内研究者们的关注。商敬敏[24]首次以云南省迪庆藏族自治州德钦县布村和茨中两地葡萄园收集的土壤样品为试验材料,分离得到葡萄酒相关酵母8个属8个种,分别为克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、橄榄假丝酵母(Candidaoleophila)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、罗伦氏隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)和黑酵母(又名出芽短梗霉,Aureobasidiumpullulans)。随后,刘胜等[25]又对上述分离纯化的菌株进行耐受性分析,发现其中葡萄汁有孢汉逊酵母YE-3和克鲁维毕赤酵母YE-4具有较好的耐受性,可能具有一定的发酵应用潜力。

史涛涛[26]则以云南省迪庆藏族自治州德钦县酿酒葡萄赤霞珠为试验材料,分别对正常成熟葡萄和冰葡萄自然发酵过程中的酵母菌进行筛选、鉴定和对比。其中,在正常成熟的赤霞珠葡萄自然发酵过程中共分离到9种酵母:发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)、橄榄假丝酵母(Candidaoleophila)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、Saturnisporasaitoi(未见译名)、西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)、陆生伊萨酵母(Issatchenkiaterricola)、一种假丝酵母(Candidasp.)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae);而在冰葡萄自然发酵过程中共发现了5种酵母:浅黄隐球酵母(Cryptococcusflavescens)、一种隐球酵母(Cryptococcusamylolentus)、生丝毕赤酵母(Hyphopichiapseudoburtonii)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。而在该研究中分离到的Cryptococcusamylolentus(最初从南非的甲虫上分离到)和Hyphopichiapseudoburtonii两种酵母则并未在相关研究中出现,关于这两种酵母的来源和生理特性有待进一步探究。

秦伟帅等[27]对香格里拉葡萄酒产区葡萄果实及土壤中分离获得的76株酵母菌株进行序列测定。结果表明,这些菌株在亲缘关系上可归类于9个属10个种,其中优势菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),其次是巴布维红冬孢酵母(Rhodosporidiumbabjevae)和葡萄酒有孢汉生酵母(Hanseniasporauvineae)。利用改良模拟葡萄汁培养基对菌株耐受性进行分析,发现酿酒酵母菌株CZ11和BZL12可以耐受较高的酒精度和较高的糖度,同时还可在低温下发酵,因此可能具有冰酒发酵应用的潜力。

本课题组也于2017～2018年对云南香格里拉金沙江和澜沧江流域各代表性葡萄园中葡萄酒相关酵母进行分离和鉴定,所获得代表性菌株可归为10个属和11个种。除分离获得上述多数酵母种属外,还首次在该区域分离得到Meyerozyma属酵母,希望能对云南及本土葡萄酒产区酵母多样性研究进行补充。

国内外大量关于酿酒葡萄果实上酵母分布的研究均有一个共同特点,就是酿酒葡萄果实上大多以非酿酒酵母为主,而主导发酵过程的酿酒酵母在葡萄果实上并不普遍存在。有研究表明,大约千分之一的葡萄果实上可检测到酿酒酵母的存在[28]。因此,一些研究者提出过葡萄酒自然发酵过程中的酿酒酵母可能主要来源于酒厂的观点[29]。

3 葡萄酒特色酵母种属及在酿酒中的应用

通过与国内其他产区相对比可以发现[30],云南葡萄酒产区蕴含着丰富的酵母菌种质资源。此外,非酿酒酵母因其独特的发酵和酿酒特性而越来越多受到葡萄酒生产者和研究者们的关注。根据已有的研究,存在于云南葡萄酒产区的非酿酒酵母至少有15个属30个种,这些非酿酒酵母的种属及在酿酒中的应用如表1所示。

表1 云南葡萄酒产区非酿酒酵母种属及其酿酒应用Table 1 Non-Saccharomyces species in Yunnan wine producing regions and their application in wine-making

3.1 增加甘油含量

甘油(丙三醇)是葡萄酒发酵过程中酵母重要的代谢产物,其在葡萄酒中的含量仅次于水和乙醇[31]。甘油具有一定的甜味和黏性,故其可以赋予葡萄酒圆润的特性,同时还可以平衡酸感,增加口感的复杂性[32]。与酿酒酵母相比,一些非酿酒酵母具有较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性,会在发酵过程中代谢生成更多的甘油[33]。Shekhawat等[13]对比了厌氧条件下酿酒酵母和非酿酒酵母发酵模拟葡萄汁的差异,结果表明,纯种戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)和美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)发酵模拟葡萄汁代谢生成甘油量均显著高于纯种酿酒酵母。此外,该研究还发现,采用非酿酒酵母与酿酒酵母协同发酵,不仅可以进一步提高甘油的产量,同时还可以降低乙酸和乙醛的含量。

3.2 降低酒精含量

受全球气候变暖的影响,国内外一些产区的酿酒葡萄果实可溶性固形物含量有时可高达24 °～25 ° Brix,而以此为原料采用酿酒酵母发酵生产的葡萄酒通常具有较高的酒精度(>15% v/v)[34]。过高的酒精度不仅会影响葡萄酒的风味,而且还会引发一系列健康问题[35]。由于一些非酿酒酵母具有相对较低的酒精转化率,我们可以利用其这一特性来降低葡萄酒中酒精的含量或生产低醇葡萄酒。采用星形假丝酵母(Candidastellata)和美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima),与酿酒酵母串联发酵能够降低模拟葡萄酒中的酒精含量,且不同菌株间降低酒精的效果还有明显差异[36]。另外,一些毕赤酵母属酵母(Pichia)在通气条件下发酵也可在一定程度上降低葡萄酒中酒精含量[37]。

3.3 生物增酸或降酸

葡萄酒中的有机酸是其重要的风味物质,这类物质主要来源于酿酒葡萄果实(酒石酸、苹果酸和柠檬酸等)和发酵过程(乙酸、乳酸和琥珀酸等)[38]。葡萄酒中各种有机酸的种类与含量对其酸度平衡、口感、色泽及生物稳定性等具有重要作用[39]。有研究表明,采用星型假丝酵母(Candidastellata)纯种发酵或结合酿酒酵母发酵能显著提高灰比诺葡萄酒中琥珀酸的含量,因此这种发酵方式可能会在一定程度上对酸度不足的葡萄酒产生积极影响[40]。此外,有研究指出,陆生伊萨酵母(Issatchenkiaterricola)不仅可以降解苹果酸,而且还具有降解柠檬酸的能力[41],因而可利用其进行生物降酸,酿造全汁树莓干型酒[42]。

3.4 降解氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate)是发酵食品制作或储存过程中产生的副产物,具有潜在致癌作用。其在葡萄酒中主要由酵母降解精氨酸产生的尿素和乳酸菌降解精氨酸产生的瓜氨酸与乙醇自发反应产生[43]。葡萄酒中氨基甲酸乙酯的控制方法主要有选育低产尿素酵母菌株、调整葡萄汁成分和调整工艺条件等[44]。目前已有研究表明,一些红酵母属酵母(Rhodotorula)具有产生氨基甲酸乙酯降解酶的能力,并成功应用于黄酒中氨基甲酸乙酯的去除[45],但其能否应有效用于葡萄酒,还有待进一步的尝试与研究。

3.5 增香酿造

挥发性香气物质是评价葡萄酒品质的重要特征之一,依据其来源可分为:品种香气、发酵香气和陈酿香气三类[46]。非酿酒酵母主要是通过直接产生挥发性代谢物(发酵香气),如酯类[12]、高级醇[47]、硫醇[48]和脂肪酸等,和(或)分泌胞外酶,如β-糖苷酶[49],降解来源于葡萄果实的相应糖苷结合态香气物质前体(品种香气)来改善葡萄酒的香气品质。

葡萄酒中的酯类香气主要是具有花果类香气的乙酸酯和脂肪酸乙酯。在发酵过程中,乙酸及脂肪酸首先通过酰基辅酶A合成酶形成相应的酰基辅酶A,再与乙醇或高级醇在醇乙酰基转移酶和酯酶的作用下生成相应的酯。研究表明,与酿酒酵母相比,葡萄汁中孢汉逊酵母(Hanseniasporavineae)在发酵期间能产生大量乙酸酯,特别是具有玫瑰、蜂蜜以及花果香味的乙酸苯乙酯[50]。此外,具有耐高渗能力的戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)和毕赤酵母属酵母(Pichia)也能为葡萄酒带来更多的酯类香气物质[51-52]。

葡萄酒中的高级醇含量过高会产生苦味、涩味和辛辣感等负面影响,但适量的高级醇却可以增加葡萄酒的复杂性,赋予葡萄酒以醇厚感[53]。通常非酿酒酵母会比酿酒酵母产生更多的高级醇,但不同菌株间的差异较大[54]。刘阳等[55]发现假丝酵母属酵母(Candida)和毕赤酵母属酵母(Pichia)对柑橘果醋具有良好的增香效果,其中所使用的毕赤酵母发酵的果醋中苯乙醇含量可达总香气物质总量的85%以上;在另一项高产苯乙醇酵母菌的研究中也表明,毕赤酵母属酵母具有高产苯乙醇的特性[56]。原苗苗等[57]在非酿酒酵母模拟葡萄汁产香性研究中则证实了美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)也具有较强的高级醇特别是异戊醇和苯乙醇的生成能力。

硫醇类化合物是有机硫化物的一种,少量该物质有着水果的清香,但过量则会产生刺鼻的蒜味。但对于长相思和赤霞珠葡萄酒,较高含量的不稳定硫醇却能强化其品种特征[53]。假丝酵母属酵母(Candidazemplinina)和克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)均可产生大量挥发性硫醇及其酯,如3-巯基己醇和3-巯基己醇乙酸酯,这两种物质对于长相思和赤霞珠葡萄酒的风味有着重要的贡献[58]。

葡萄酒中一些挥发性香气物质,如香茅醇、芳樟醇、橙花醇、香叶醇及松油醇等,在葡萄汁中主要以不具有挥发性的糖苷结合态形式存在[59]。一些非酿酒酵母,如胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)[60]、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporavineae)[61]和葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)[6]等具有高产β-糖苷酶的能力,可促进一些萜烯类和C13-降异戊二烯类糖苷的水解,从而增加葡萄酒的花香、果香和坚果香。

3.6 其他应用

国内有研究者以废弃烟叶为原料,将黑酵母(又名出芽短梗霉,Aureobasidiumpullulans)用于烟叶衍香香料的制备,相对于烟叶浸膏,所制备衍生香料致香成分的种类和含量均明显增加[62]。此外,国内外还有研究表明,一些Aureobasidiumpullulans菌株可以产生多种酶类[63],虽然其中很多酶类与酿酒应用相关,但该菌株在酿酒应用方面的研究则几乎没有涉及,也许未来会有相关的研究出现。在该产区分离和鉴定的Meyerozymaguilliermondii酵母有研究者发现其具有耐盐特性,将其用于酱油发酵也具有一定的增香效果[64]。此外,虽然隐球酵母属酵母(Cryptococcu)[65]和德巴利酵母属酵母(Debaryomyces)[66]在酿酒应用研究中涉及较少,但它们对一些植物病原菌有抑制作用,因此可用做生防菌。另外一些酵母,如红冬孢酵母属酵母(Rhodosporidium)[67]则具有产生生物学功效色素的能力。

4 总结与展望

酵母菌的分布与地理位置和气候条件等密切相关,我国葡萄酒产区主要位于35～40 ° N,仅在云南有很小一部处于28～30 ° N。该产区具有复杂的地形地貌和丰富的气候类型,具有特色酵母种质资源研究和开发的独特条件。根据已有的研究,存在于云南葡萄酒产区的非酿酒酵母至少有15个属30个种。虽然其中一些非酿酒酵母种属,如汉逊酵母属(Hanseniaspora)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和梅奇酵母属(Metschnikowia)等已应用于酿酒研究与生产中并体现出一定的优势,但还有很多存在于该产区的特色非酿酒酵母种属还未涉及,因此需要进一步探索和尝试其发酵特性及在酿酒中的应用。此外,目前关于非酿酒酵母对葡萄酒风味影响的研究大多集中于非酿酒酵母与酿酒酵母协同发酵等方面。虽然试验结果表明非酿酒酵母确实具有酿造特色葡萄酒的潜力,但对于其特征风味物质及代谢机理研究的涉及很少。相信通过国内外研究者们的共同努力,在非酿酒酵母酿造特色葡萄酒的理论研究和生产实践上都取得突破。