抗镉植物内生真菌的筛选及其促生能力研究

刘军生，罗阳兰，解修超，邓百万，柏秋月，曹乃馨,张毓文

(1.陕西理工大学/陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中 723001； 2.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

镉是对环境危害较大的重金属污染物之一，会随着食物链进入人体，进而危害人体健康。物理、化学修复镉污染土壤技术成果显著，如钝化、玻璃化等技术，但成本较高、修复不彻底等问题较为突出[1-2]，植物-微生物联合修复镉污染土壤技术成本低廉、方便易行、无二次污染[3]。因此，研究和完善植物-微生物联合修复技术，筛选具有抗镉促生能力的微生物菌株，对增强植物抗镉能力，提高污染土壤修复效率具有重要意义。

植物内生真菌(Endophyte fungi)是生活史的部分或全部阶段位于健康植物组织和器官间隙内，并与之建立和谐关系的各种真菌。内生真菌与宿主植物的协同进化过程中可产生植物激素类物质如吲哚-3-乙酸(IAA)和铁载体等次级代谢产物，协助宿主植物抵御病原菌及不良的生长环境[4-6]，亦或在植物的遗传、生理和生态水平上改变宿主植物对外界环境的应激反应[7]，提高其抗逆性，促进宿主植物的生长[8-9]，从而有利于宿主植物对重金属的吸收、积累和转运[10-12]。张兴旭[13]研究认为，内生真菌侵染可以缓解镉胁迫对醉马草的毒害作用，并提高其抗病虫害能力。魏玮[14]研究发现，碱蓬内生真菌接入水稻后可显著提高水稻对镉和盐胁迫的抗逆性，说明部分内生真菌可以在不同宿主植物间生存并提高宿主植物的抗镉能力。目前，我国大部分镉污染农田采用“边生产边修复”的方式进行耕作，在保护耕地的同时提高产量，筛选抗镉菌株与大田作物共同构建植物-微生物联合体系，成为安全环保、简便有效的抗镉途径。

本研究采集秦岭铅锌尾矿区优势植物，并从中分离筛选出5株镉耐受性为30 000 mg/L的内生真菌，测定镉离子(Cd2+)去除率，研究其对小麦幼苗的促生能力，以期为植物-微生物联合修复农田镉污染提供优势菌株，提高农田镉污染修复效率。

1 材料和方法

1.1 材料

供试植物杠柳(PeriplocasepiumBunge)于2017年3月采自陕西省汉中市略阳县(东经106°16′、北纬33°34′)。剪取健康杠柳植株的根和茎，用自封袋带回实验室，24 h内分离其内生真菌。

1.2 仪器

SW-CJ-1D型单人超净工作台(上海苏净实业有限公司)、YXQ-LS-50S型高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、UV 2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)、A 320原子吸收分光光度计 (上海精密仪器有限公司)。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)分离培养基：马铃薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氢钾5.0 g/L、硫酸镁3.0 g/L、琼脂15.0 g/L、水1 000 mL、pH值自然。

PDA加镉培养基：在PDA分离培养基中分别加入10 000、15 000、20 000、25 000、30 000 mg/L氯化镉。

PDA 琼脂斜面培养基：与PDA分离培养基配方相同。

PDA液体培养基：马铃薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氢钾5.0 g/L、硫酸镁3.0 g/L、水1 000 mL、pH值自然。

溶磷培养基：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3(PO4)210.0 g、蒸馏水1 000 mL、琼脂20.0 g。

解钾培养基：钾长石2.5 g、Na2HPO40.2 g、MgSO4·

7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35.0 g、葡萄糖10.0 g、CaSO4·7H2O 0.1 g。

1.4 方法

1.4.1 抗镉内生真菌的分离 将杠柳的根和茎用流水冲洗干净、75%乙醇处理1 min，之后用无菌水冲洗4次、0.1%升汞处理8 min，然后用2.5%次氯酸钠消毒4 min、无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干水分，解剖刀切成1 cm小段，置于PDA分离培养基，于28 ℃恒温箱倒置培养。对培养出的内生真菌进行纯化，按照纯化出的先后顺序将菌株编号为GR1、GR2、GR3、GR4、GR5、GR6、GR7、GR8、GR9。将纯化后的内生真菌转接入PDA加镉培养基，进行抗镉内生真菌的筛选，筛选出的菌种接种于PDA琼脂斜面培养基，4 ℃冷藏。

1.4.2 抗镉内生真菌菌株的鉴定

1.4.2.1 抗镉内生真菌形态分析 将筛选所得抗镉内生真菌菌株分别接种于PDA分离培养基和30 000 mg/L的PDA加镉培养基，采用棉蓝染色法[15]在光学显微镜下观察菌丝体的形态和大小[16]，参考文献[17]对其进行基本分类。

1.4.2.2 抗镉内生真菌内转录间隔区基因序列(Internal transcribed sequence, ITS)序列测定 利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取抗镉内生真菌DNA，采用抗镉内生真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 对ITS基因序列进行扩增。聚合酶链式反应(PCR)反应体系50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL、10 μmol/L引物各2 μL、模板DNA 1 μL(含量10 ng/μL)，ddH2O补齐至50 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，32个循环后4 ℃保存。将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果整理后进行Blast比对，并提交NCBI申请、获得登录号，利用MEGA 7.0构建系统发育树。

1.4.3 抗镉内生真菌Cd2+去除率测定 采用原子吸收分光光度法测定Cd2+初始含量。将抗镉内生真菌活化后进行去除试验，试验条件设定为：转速140 r/min、接种量2%、pH值 7.0、培养温度28 ℃，在PDA液体培养基中加入氯化镉使Cd2+终含量为1 000 mg/L，以含镉但不接菌的PDA液体培养基为对照。培养15 d后，将发酵液抽滤去除菌丝体，滤液10 000 r/min离心12 min，取上清液过0.22 μm滤膜用于测定Cd2+残留含量，以不含菌但含Cd2+的培养基为对照，去除率按以下公式计算：

Cd2+去除率=(C0-C)/C0×100%，

其中，C0为Cd2+的初始含量(mg/L)，C为Cd2+的残留含量(mg/L)[18]。

1.4.4 抗镉内生真菌促生能力测定

1.4.4.1 IAA活性 进行产IAA抗镉内生真菌的初筛，发酵液与Salkowski比色液等比例混合后，混合液颜色呈粉红色者为阳性( +)，表示抗镉内生真菌具有IAA活性，混合液颜色越深表示IAA活性越高；混合液不变色者为阴性( -)，表示抗镉内生真菌无IAA活性。将Salkowski比色液与发酵液离心后的上清液等比例混合，于暗处静置30 min后，测定OD530值。分析纯IAA梯度稀释后，以浓度为横坐标、OD530值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算抗镉内生真菌的IAA活性[19]。

1.4.4.2 铁载体活性 用铁载体活性(SU)表示铁载体的产量，根据以下公式计算抗镉内生真菌铁载体活性=(Ar-As)/Ar×100%，

其中,Ar为铁载体检测液的吸光值，As为铁载体检测液与内生真菌发酵液混合后的吸光值[20]。

1.4.4.3 胞外过氧化氢酶(CAT)活性 CAT活性采用钼酸铵法[21-22]测定，定义1s内催化氧化1 μmol H2O2所需的样品量为 1个CAT活力单位(UC)，根据以下公式计算抗镉内生真菌CAT活性=[(A1/A0-0.056)/0.564×V]/t，

其中,A1为样品吸光度，A0为对照吸光度，V为反应体系体积，t为反应时间。

1.4.4.4 溶磷解钾活性 采用透明圈法进行定性试验[23]，采用钼锑抗比色法及四苯硼酸钠法进行溶磷解钾定量试验[24-25]。

1.5 小麦验证试验

1.5.1 小麦种子活力测定 采用氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)法测定供试小麦种子活力[26]。

1.5.2 不同含量Cd2+对小麦幼苗生长、生理指标的影响 将珍珠岩灭菌后，加入含Cd2+的Hoagland营养液，使Cd2+的终含量分别为1、5、10、15、20、25、20、35 mg/kg，无Cd2+的Hoagland营养液作空白对照，拌匀后平衡一周用于后续试验。把小麦种子先在25～30 ℃的水中浸泡10 h，再整齐而均匀地种在不同Cd2+含量水平的珍珠岩发芽床上，每组3盆重复，置于光照培养箱[28 ℃、16 h(光照强度3 000 lx)，26 ℃、8 h(无光照)，相对湿度75%]培养，定期观察，待小麦幼苗抽出第3片真叶后，收获并测其苗高、根长、鲜质量、干质量、叶绿素含量(采用80%丙酮比色法测定[27])、可溶性糖含量(采用苯酚-浓硫酸法测定)、可溶性蛋白含量(采用考马斯亮蓝法[28]测定)等指标。

1.5.3 不同抗镉内生真菌发酵液对镉胁迫条件下小麦幼苗生长、生理指标的影响 将5株抗镉内生真菌分别接入PDA液体培养基，置于恒温水平摇床(140 r/min、28 ℃)培养10 d后，抽滤菌丝体，收集发酵液滤液备用。待小麦长出胚根后，用10 mL发酵液浇灌受10 mg/kg Cd2+胁迫的小麦幼苗，筛选出能提高小麦幼苗耐镉能力的内生真菌，以不含菌的培养基、无菌水为对照。每组3盆重复，培养条件同1.5.2，待小麦幼苗抽出第3片真叶后，收获并测其生长、生理指标(同1.5.2)。

1.6 数据处理与分析

用Microsoft excel 2010软件进行数据计算和绘图, 用SPSS 24.0软件进行方差和数据变异分析。

2 结果与分析

2.1 抗镉内生真菌形态分析

图1、2表明，菌株GR1在PDA培养基上的菌落形态呈淡黄色厚绒状，边缘整齐、呈白色，表面干燥。菌丝体有螺旋状结构、有横隔，分生孢子梗呈帚状，产生绿色分生孢子。而在PDA加镉培养基上培养30 d后，菌株GR1菌落形态发生了明显变化，以基生菌丝为主，边缘有色素沉着，分生孢子颜色加深、孢子壁加厚。

菌株GR4在PDA培养基上的菌落形态呈淡紫色绒毛状，气生菌丝浓密，菌丝有隔膜、分支，不规则，部分互相缠绕成束状。在PDA加镉培养基上培养30 d后，菌株GR4菌落以基生菌丝为主，边缘有色素沉着，菌丝表面附着有红色分泌物。

菌株GR9在PDA培养基上的菌落形态呈紫色绒毛状,圆形、隆起，气生菌丝浓密。而在PDA加镉培养基上培养30 d后,菌株GR9菌落以基生菌丝为主，表面附着有白色结晶物质。

菌株GR7、GR10在PDA培养基上的菌落形态呈紫白色棉絮状,圆形、隆起，气生菌丝旺盛, 菌丝体有分隔和分枝。在PDA加镉培养基上培养30 d后，菌株GR7、GR10菌落以基生菌丝为主，表面有浅紫色色素沉着，菌丝加粗、不规则，附着胞明显。

图1 PDA培养基上抗镉内生真菌菌株形态Fig.1 Morphology of cadmium resistant endophytic fungi strains in PDA medium

图2 PDA加镉培养基上抗镉内生真菌菌株形态Fig.2 Morphology of cadmium resistant endophytic fungi strains in cadmium-added PDA medium

2.2 抗镉内生真菌ITS序列测定

通过平板培养法筛选出5株在30 000 mg/L Cd2+含量平板上生长良好的抗镉内生真菌。经测序后，提交至GenBank数据库进行序列分析和相似性比较，建立系统发育树 (图3)。结果显示，筛选出的抗镉性较高的5株抗镉内生真菌菌株中，GR1、GR4、GR9分别与Talaromycessp.、Colletotrichumsp.、Purpureocilliumsp.中的ITS基因序列具有99%的高度相似性，而GR7、GR10与Fusariumsp.中的ITS基因序列具有99%的高度相似性。

图3 抗镉内生真菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of cadmium resistant endophytic fungi

2.3 抗镉内生真菌Cd2+去除率测定

对重金属离子的去除率是衡量内生真菌菌株修复能力的重要指标，内生真菌可以利用生物多聚物如胞外多糖和铁载体将重金属离子螯合于胞外基质，或者利用金属结合蛋白(多肽)等重金属特异性结合大分子结合重金属离子，并将其吸收、贮存在细胞内。抗镉内生真菌Cd2+去除率见图4，各菌株Cd2+去除率按大小依次排序为：GR7>GR9>GR4>GR1>GR10。其中,GR7、GR9、GR4的Cd2+去除率均达60%以上，说明GR7、GR9、GR4在高含量镉污染环境中具有较大的修复潜力。

2.4 抗镉内生真菌促生能力测定

2.4.1 IAA活性 如表1所示，5株抗镉内生真菌中有1株菌株IAA分泌能力为“+++”，3株菌株IAA分泌能力为“+”。菌株GR9无IAA活性，其余4株抗镉内生真菌的 IAA活性之间有显著性差异，IAA活性在13.641～99.417 mg/L，其中,GR4的IAA活性最强，为99.417 mg/L，其后依次是GR1、GR7、GR10，说明GR4对宿主植物有较强的促生潜力。

图4 抗镉内生真菌Cd2+去除率Fig.4 Cd2+ removal rate of cadmium resistantendophytic fungi

菌株 Strains IAA分泌能力IAA secretion abilityIAA活性/(mg/L)IAA activityGR1+17.458±0.42bGR4+++99.417±0.59aGR7+14.443±0.39cGR9--GR10+13.641±0.06d

注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05),the same below.

2.4.2 铁载体活性 在内生真菌的代谢过程中，铁元素作为激活剂和催化基团，在酶作用过程中起到重要的作用[29]，为了更好地适应环境，微生物会合成和分泌一种对三价铁离子具有高螯合力的小分子物质——铁载体，以满足自身生长需求[30]。同时铁载体还可以结合重金属离子，降低环境中有效态重金属含量。如图5所示，5株抗镉内生真菌发酵液中均含有铁载体，且SU值在38.68%～84.64%，活性较高。其中，GR7的SU值为84.64%，GR4的SU值为78.50%，而且GR7和GR4对Cd2+也有较高的去除率，说明铁载体活性在内生真菌抗镉性能方面可能也有重要作用，且具有活性的铁载体可以为内生真菌和宿主植物提供生长发育所必需的铁元素，促进内生真菌和宿主植物的生长。

图5 抗镉内生真菌铁载体活性Fig.5 Siderophore activity of cadmiumresistant endophytic fungi

2.4.3 胞外CAT活性 CAT是生物防御系统的关键酶之一，可把对植物生长有害的过氧化氢分解为水和氧气, 是降低过氧化氢毒害作用及合成腐殖质的重要氧化还原酶。如图6所示，4株抗镉内生真菌发酵液的UC值为6.14～10.01 U/mL，活性较高。其中，GR9的UC值为10.01 U/mL，GR1的UC值为8.04 U/mL，而GR10未检测到胞外CAT活性。

图6 抗镉内生真菌胞外CAT活性 Fig.6 Extracellular CAT activity of cadmiumresistant endophytic fungi

2.4.4 溶磷解钾活性 磷、钾是植物生长所必需的营养元素，土壤中虽含有丰富的磷、钾，但由于大部分磷、钾以难溶性盐或氧化物的形式存在，导致植物无法直接吸收利用[31]。溶磷解钾微生物可将矿物态磷、钾转变为可以被植物吸收的有效磷、有效钾，为植物及其他微生物提供磷源和钾源，在土壤磷、钾循环中起重要作用[32]。微生物的溶磷解钾活性越强，将矿物态磷、钾转变为可溶态、有效态磷钾的能力越强，测定溶液中有效态磷、钾的含量可确定微生物溶磷解钾活性的大小。如表2所示，5株抗镉内生真菌中，GR1、GR9菌株发酵液中有效磷含量分别为201.67、195.09 mg/L，具有较强的溶磷能力；GR4、GR9发酵液中有效钾含量分别为105.11、97.22 mg/L，具有较强的解钾能力。菌株GR9既有溶磷能力又有解钾能力。

表2 抗镉内生真菌溶磷解钾活性Tab.2 Phosphorus and potassium dissolution activity ofcadmium resistant endophytic fungi mg/L

2.5 小麦验证试验

2.5.1 小麦种子活力测定 小麦种子活力介于97% ～99%，平均值为98%，可用于试验。

2.5.2 不同含量Cd2+对小麦幼苗生长、生理指标的影响 镉胁迫会影响小麦幼苗的生物量、叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量等生长、生理指标。如表3所示，随着Cd2+含量的增加，小麦幼苗的生长总体呈下降趋势，在Cd2+含量为1 mg/kg时，小麦幼苗的株高、根长、鲜质量、干质量、叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量与对照相比无显著差异。Cd2+含量增加到5 mg/kg时小麦幼苗的生长受到明显抑制,株高、根长、鲜质量、干质量、叶绿素含量与对照相比显著降低，而可溶性糖含量、可溶性蛋白含量显著增加，说明5 mg/kg的Cd2+不仅对小麦幼苗的生长产生明显的抑制作用，并且使其氧化应激产物含量显著上升。当Cd2+含量增加到10 mg/kg时，小麦幼苗的株高、根长、鲜质量、干质量、叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量与对照相比均显著下降。

表3 不同含量Cd2+对小麦幼苗生长、生理指标的影响 Tab.3 Effects of different content of Cd2+ on growth and physiological index of wheat seedlings

2.5.3 不同抗镉内生真菌发酵液对镉胁迫条件下小麦幼苗生长、生理指标的影响 如表4所示，加入不同抗镉内生真菌发酵液后，与空白相比，对照的株高、鲜质量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量均显著增加，这是因为培养基中含有部分对小麦幼苗生长有益的营养物质。与对照相比，添加GR1、GR4、GR7、GR9发酵液后的小麦幼苗的生长、生理指标均有显著增加。与对照相比，添加GR1发酵液的小麦幼苗株高增加了80.22%，根长增加了61.26%，鲜质量增加了27.66%，干质量增加了60.87%，叶绿素含量增加了28.42%，可溶性糖含量增加了7.83%，可溶性蛋白含量增加了13.28%，整体促进效果显著。与对照相比，添加GR10发酵液的小麦幼苗的鲜质量和干质量差异不显著，其余生长、生理指标均显著增加。由此可见，抗镉内生真菌能够通过提高宿主植物的叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量来帮助小麦幼苗抵抗逆境，增加小麦幼苗的生物量，并提高其耐镉能力。

表4 不同抗镉内生真菌发酵液对镉胁迫条件下小麦幼苗生长、生理指标的影响 Tab.4 Effects of fermentation broth of different cadmium resistant endophytic fungi on growth and physiologicalindex of wheat seedlings under cadmium stress

3 结论与讨论

当植物受到镉胁迫时，其抗氧化酶系统能够减少自身受到的伤害，但当逆境胁迫负荷过大时，会使其生长受到抑制，甚至造成死亡[33]。内生真菌的加入可以提高植物对镉的耐受和吸收能力，同时改变植物体内部分活性物质的含量，增强其抗逆能力，促进植物的生长发育。内生真菌与宿主植物经过长期的协同进化，对宿主植物具有促生、抗逆作用而又不造成危害，利用抗镉内生真菌构建植物-微生物联合修复体系，方便高效、安全环保，是一种具有潜力的生物修复技术。

抗镉内生真菌在植物-微生物联合修复体系中主要有两方面的作用，其一为吸附、固定环境中或植物体内的Cd2+，降低植物的镉胁迫压力；其二为促进植物生长。研究抗镉内生真菌的耐镉和促生能力有利于筛选出适用于构建植物-微生物联合修复体系的优势菌株。本研究结果显示，5株抗镉内生真菌中菌株GR4的IAA活性最高(99.417 mg/L)，菌株GR7的铁载体活性最高(84.64%)，菌株GR9的胞外CAT活性最高(10.01 U/mL)，菌株GR1的有效磷含量最高(201.67 mg/L)，菌株GR4的有效钾含量最高(105.11 mg/L)。5株抗镉内生真菌均能显著提高小麦幼苗的耐镉能力，与对照相比，添加GR1发酵液的小麦幼苗株高增加了80.22%，根长增加了61.26%，鲜质量增加了27.66%，干质量增加了60.87%，叶绿素含量增加了28.42%，可溶性糖含量增加了7.83%，可溶性蛋白含量增加了13.28%，整体促进效果较为显著。尹艺等[34]研究发现，碱蓬内生真菌EF11-01可以提高水稻对镉胁迫的抗性，促进水稻生长,提高叶绿素含量，增强抗氧化防御能力，与本研究的结果相一致。

本研究分离筛选到的5株内生真菌，经鉴定GR1为Talaromycessp.，GR4为Colletotrichumsp.，GR9为Purpureocilliumsp.，而GR7和GR10均为Fusariumsp.。其中，踝节菌属(Talaromycessp.)作为一个重要的内生真菌属，产生了多种新的天然产物如生物碱类[35]、蒽酮类[36]和聚酯类化合物[37]，但作为抗镉内生真菌尚属首次报道。刺盘孢属(Colletotrichumsp.)多为植物病原菌，引起植物炭疽病等[38-40]。淡紫拟青霉属(Purpureocilliumsp.)的生防潜力巨大[41-42]，镰刀菌属(Fusariumsp.)的生态学功能比较复杂，既可致病又可防病，还有良好的重金属吸附能力。徐在超等[43]研究发现，油菜内生真菌Fusariumsp.CBRF14对镉的最大吸附量为20.5 mg/g，对铅的最大吸附量为299.8 mg/g，对锌的最大吸附量为28.4 mg/g。杨亮等[44]研究发现，镰刀菌PY在铅离子质量浓度为750 mg/L时吸附率为77.9%，具有较高的抗铅性。本研究筛选到GR7和GR10，也有一定的镉去除率。

本研究筛选的内生真菌均具有较强的镉抗性，同时又具有一定的促生潜力，可为植物-微生物联合修复镉污染农田提供优势菌株，提高镉污染修复效率。本试验并未测定珍珠岩中剩余的有效态镉和总镉含量，以及小麦地上部分和地下部分有效态镉和总镉含量，因此，小麦抗镉能力的提升是否与小麦吸收了更多的镉，并使之在体内以无效态沉积下来有关，尚需进一步研究。另外，小麦抗镉能力增加是否会使小麦种子中的镉含量增加，需要进一步研究。