超声波辅助乙醇提取大蒜中大蒜油的研究

张轩

(武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205)

大蒜是我国一大优势资源，年产量占世界总量的1/4，出口量居世界第4位[1]。大蒜油又称大蒜素，是大蒜破碎以后，由蒜氨酸在蒜氨酸酶作用下形成的一种油状有机硫化物，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、降脂降糖、保护心脑血管健康、提高机体免疫力等作用[2-3]。大蒜油的开发不仅具有很好的商业价值，还可提高大蒜这一农产品的附加值，对农业现代化、农民增收起到积极的促进作用[4]。相比目前文献所报道的单纯的超声波辅助有机溶剂提取大蒜油[5-7]，本课题将蒜氨酸酶活性调控理论应用到提取工艺中，以期提高大蒜油的提取率，为工业上大蒜油的获取提供有一定价值和意义的参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

白皮大蒜；无水乙醇、氯化锰、氯化镁、磷酸吡哆醛(PLP)、甘油、氯化钡、硝酸、甲基橙等均为分析纯。

722 型可见分光光度计；HH-S6型恒温水浴锅；FA2014B型电子分析天平；DFY-300型组织捣碎机；MEC-200SAH型超声波合成萃取仪；RE52-CS型旋转蒸发器。

1.2 实验方法

大蒜去皮后用组织捣碎机捣碎。取30 g蒜泥(精确到0.01 g)放入250 mL三角瓶中，加入15 mmol/L氯化锰溶液、2 mmol/L PLP溶液、10 mmol/L甘油、10 mmol/L氯化镁溶液各5 mL，在35 ℃，pH 6.5条件下酶解60 min。放入超声波合成萃取仪中，添加95%乙醇，液料比为5∶1 mL/g，超声功率600 W，在35 ℃下超声萃取50 min。

根据GB 8862—1988《脱水大蒜挥发性有机硫化合物的测定方法》，以浓硝酸滴定大蒜油样品，将其中的硫醚基团氧化成硫酸根离子，再采用硫酸钡沉淀称重法换算出大蒜油中有机硫化物的含量[8]。

2 结果与讨论

2.1 蒜氨酸酶促反应条件对大蒜油提取率的影响

2.1.1 酶促反应温度对大蒜油提取率的影响 取新鲜蒜泥6份，每份30 g，酶解温度分别为25，30，35，40，45，50 ℃，其他提取条件保持不变，结果见图1。

图1 酶促反应温度对大蒜油提取率的影响Fig.1 Effect of enzymatic reaction temperature on extraction rate of garlic oil

由图1可知，随着温度的提高，蒜氨酸酶的催化效率提高，温度35 ℃时，大蒜油的提取率最高，为0.397%，温度继续升高，酶蛋白逐渐变性失活，相应大蒜油的提取率开始降低。因此，选择最适酶解温度为35 ℃。

2.1.2 酶促反应pH对大蒜油提取率的影响 取新鲜蒜泥5份，每份30 g，用磷酸缓冲液调节蒜泥pH分别为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，其他提取条件保持不变，结果见图2。

图2 酶促反应pH对大蒜油提取率的影响Fig.2 Effect of enzymatic reaction pH on extraction rate of garlic oil

pH直接影响着蒜氨酸酶活性中心基团的解离，对蒜氨酸酶活性影响显著。由图2可知，随着pH的升高，大蒜油的提取率先升高后降低，在pH为6.5 时，大蒜油的提取率最高，为0.385%，这一趋势同蒜氨酸酶的酶学性质研究结果一致[9]。选择最适酶解pH为6.5。

2.1.3 酶促反应时间对大蒜油提取率的影响 取新鲜蒜泥6份，每份30 g，控制酶解时间，其他提取条件保持不变，结果见图3。

图3 酶促反应时间对大蒜油提取率的影响Fig.3 Effect of enzymatic reaction time on extraction rate of garlic oil

由图3可知，随着酶解时间的延长，大蒜油的提取率逐渐上升，但当酶解时间>60 min后，大蒜油的提取率上升趋于平缓，100 min后提取率开始下降。推测可能随着酶解时间的延长，大蒜油中有机硫化物被催化为其他副生产物。综上，选择最适酶解时间60 min。

2.1.4 外加酶激活剂对大蒜油提取率的影响 PLP是蒜氨酸酶重要的辅酶因子，外源添加PLP可提高蒜氨酸酶活，其通过与酶蛋白的亚基结合，催化裂解底物蒜氨酸，Mn2+则通过静电作用促使底物结合在酶活性中心靠近PLP的部位，从而促进酶反应的进行，是蒜氨酸酶良好的激活剂[10]。甘油作为反应体系中引入的多羟基化合物，在Mg2+的配合使用下，可保护蒜氨酸酶活性，同时因其亲水性，减弱了酶蛋白与水分子之间的相互作用，从而促进酶蛋白疏水活性中心的形成，使底物与酶的活性中心更好地结合，有利于酶促反应的进行。

在酶解温度35 ℃、酶解pH 6.5、酶解时间60 min下，向蒜泥添加MnCl2、PLP、MgCl2、甘油溶液各5 mL，设置正交实验，确定其最适添加量。超声提取条件不变，结果见表1。

由表1可知，外加酶激活剂对大蒜油提取率的影响程度依次为PLP>Mn2+>Mg2+>甘油，大蒜油提取得率最高的最优组合为A2B3C2D2，即在最适酶反应条件下，加入2 mmol/L PLP溶液、15 mmol/L氯化锰溶液、10 mmol/L甘油、10 mmol/L氯化镁溶液各5 mL，而后进行超声波提取。在此最优条件下进行三组平行验证实验，大蒜油的提取率分别为0.445%，0.433%，0.468%，平均提取率为0.449%。

表1 正交实验结果Table 1 Orthogonal experimental results

2.2 超声提取条件对大蒜油提取率的影响

2.2.1 提取温度的影响 取新鲜蒜泥6份，每份30 g，采用最佳酶解条件酶解后，分别在25，30，35，40，45，50 ℃下进行超声提取，其他条件保持不变，结果见图4。

图4 提取温度对大蒜油提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on garlic oil extraction rate

由图4可知，在35 ℃下大蒜油的提取率最高，可达0.451%，温度继续升高，大蒜油发生降解，提取率随之下降。选择超声提取的最佳温度为35 ℃。

2.2.2 提取时间的影响 取新鲜蒜泥6份，每份30 g，采用最佳酶解条件酶解后，分别进行超声提取，其他条件保持不变，结果见图5。

由图5可知，随着提取时间的延长，大蒜油充分转移至有机相，提取率也随之提高，提取时间为50 min时，提取率最高，可达0.443%；继续延长提取时间会造成大蒜油一定程度的分解，提取率逐渐降低。选择最佳超声提取时间为50 min。

图5 提取时间对大蒜油提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on garlic oil extraction rate

2.2.3 乙醇浓度的影响 取新鲜蒜泥4份，每份30 g，采用最佳酶解条件酶解后，分别采用65%，75%，85%，95%乙醇进行超声提取，其他条件保持不变，结果见图6。

图6 乙醇浓度对大蒜油提取率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on garlic oil extraction rate

由图6可知，随着乙醇浓度的升高，大蒜油的提取率逐渐提高，说明大蒜油易溶于有机溶剂，乙醇浓度95%时，大蒜油的提取率最高，为0.451%。

2.2.4 液料比的影响 取新鲜蒜泥5份，每份30 g，采用最佳酶解条件酶解后，控制液料比分别为2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1进行超声提取，其他条件保持不变，结果见图7。

图7 液料比对大蒜油提取率的影响Fig.7 Effect of liquid to material ratio on extraction rate of garlic oil

由图7可知，随着液料比的提高，大蒜油提取率逐渐提高，液料比≥4∶1 mL/g后，提取率增长趋于平缓，提示大蒜油已被充分提取。选择最佳液料比为4∶1 mL/g。

2.2.5 超声功率的影响 取新鲜蒜泥4份，每份30 g，采用最佳酶解条件酶解后，控制超声功率分别为200，300，400，500，600 W进行超声提取，其他条件保持不变，结果见图8。

图8 超声功率对大蒜油提取率的影响Fig.8 Effect of ultrasonic power on garlic oil extraction rate

由图8可知，随着超声功率的提高，大蒜油提取率逐渐升高，超声功率500 W时，大蒜油提取率为0.443%；功率继续升高，大蒜油提取率无显著升高。选择提取功率为500 W。

2.2.6 超声提取条件正交实验结果 根据单因素实验结果，以浓度95%的乙醇作为提取剂，对提取温度、提取时间、液料比、超声功率进行正交实验，结果见表2。

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2可知，超声提取条件对大蒜油提取率的影响程度依次为：温度>液料比>功率>时间，大蒜油提取得率最高的最优组合为A2B2C3D3，即酶解后，添加浓度95%的乙醇，并控制液料比为5∶1 mL/g，超声功率600 W，35 ℃下超声萃取50 min。在此最优条件下进行三组平行验证实验，大蒜油的提取率分别为0.469%，0.473%，0.463%，平均提取率为0.468%。

2.3 对照实验

大蒜去皮用组织捣碎机捣碎后，取新鲜蒜泥3份，每份30 g，不经充分酶解，立即采用上述最佳超声提取条件提取大蒜油，大蒜油的提取率分别为0.296%，0.312%，0.288%，平均提取率为 0.299%。这说明，与传统的超声辅助提取大蒜油工艺相比，控制外部条件，将大蒜充分酶解后再进行超声提取，可显著提高大蒜油的提取率。

3 结论

超声波辅助乙醇提取大蒜中大蒜油的最佳工艺条件为：以30 g蒜泥计，加入2 mmol/L PLP溶液、15 mmol/L氯化锰溶液、10 mmol/L甘油、10 mmol/L氯化镁溶液各5 mL，在35 ℃，pH 6.5条件下酶解60 min，然后放入超声波合成萃取仪中，添加浓度95%的乙醇，并控制液料比5∶1 mL/g，超声功率600 W，在35 ℃下超声萃取50 min。在此条件下，大蒜油平均提取率可达0.468%。