磁微粒化学发光法检测儿童IGF-1的方法学性能评价

李瑞，张耀东，赵鼎，孙红启，杨俊梅，李进香

(郑州大学附属儿童医院；河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室；郑州儿童医院，河南 郑州450018)

胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor，IGF-1）也被称作“生长介素”，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽，由肝脏和其它多种组织所分泌[1]，近年来很多研究表明[2-4]，IGF-1是联系营养和生殖的纽带，是青春发育启动的重要信号之一。在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义。临床上已作为常规检测指标判断儿童骨骼生长状况。

磁微粒化学发光法是检测该项目的一种敏感、特异的快速检测方法。根据美国临床实验室改进修正案和ISO15189等文件对实验室质量的管理要求和实验室认可的要求[5，6]，检测系统在用于临床之前必须对其分析性能进行验证。本研究通过AutoLumo A2000检测系统测定IGF-1的分析灵敏度、分析内精密度、分析间精密度、线性范围、回收实验和参考区间，以验证厂商给定的性能参数，为临床应用该项目提供准确、详实、可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集我院2017年11月-12月就诊患儿的新鲜血清标本，按照要求分为高、低浓度，冰箱-20℃冻存备用。

1.2 仪器和试剂 全自动化学发光测定仪（AutoLumo A2000），胰岛素样生长因子-1检测试剂盒（豫械注准20152400476）

1.3 方法

1.3.1 分析灵敏度 将试剂盒中零浓度校准品（S0）重复测定10次，得出10次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD的RLU值，将M+2SD带入lin-log拟合的标准曲线方程中，求出对应的浓度值，即为分析灵敏度。

1.3.2 分析内精密度 按照CLSI EP5-A2文件要求[7]，选择安图公司配套的高、低值质控品（批号：2017081601）作为精密度评价的样本进行检测，1d内连续测定10次，分别计算均值（x），标准差（S）和变异系数（CV）。

1.3.3 分析间精密度 将上述两种浓度的混合血清每天测定5次，连续测定3d，分别计算均值（x），标准差（S）和变异系数（CV）。

1.3.4 线性范围 按照CLSI EP6-A2文件要求[8]，取 IGF-1高值（H）和低值（L）血清各 1份，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L 和 5L 稀释，形成系列浓度血清进行测定，以稀释后的理论值为X，实测值为Y，将所有结果标在坐标图上，计算回归方程：Y=bX+a验证线性范围，判断标准为b值在0.97～1.03 范围内，相关系数 R2≥0.9900。

1.3.5 回收实验 将高值混合样本A（浓度为535.6745ng/ml）加入到低值混合样本B（浓度为51.8905ng/ml）中，样本A与样本B的体积比例为1：4，配置成样本 C（浓度为 105.983ng/ml），分别测量样本A、B和C，各重复2次，计算平均值作为检测值，比较实际检测值和理论值的差异，计算回收率R，回收率应在80～100%范围内。

1.3.6 干扰实验 按照CLSI EP7-P文件要求[9]，⑴溶血干扰物：取新鲜乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加蒸馏水配制，血红蛋白(Hb)浓度分别为5、3、l g/L；⑵三酰甘油(TG)干扰物：取高血脂患者样本加蒸馏水配制，TG浓度分别为12、6、3mmol/L；⑶胆红素干扰物：取黄疸患者样本加蒸馏水配制，总胆红素(TBil)浓度分别为 150、100、50umol/L；⑷计算：低水平样本和高水平样本各分成2份，每份样本重复测定5次计算分析干扰值：干扰值=T-C，即各组均值-未加干扰物相应组的均值。干扰值在对照组1.96s(95%可信区间)范围内为无显著干扰。

1.3.7 参考区间 选择在线性范围内的高值样本1份，用系统稀释液按照说明书最大稀释倍数5倍进行稀释，测定原高值样本和稀释后样本各2次，得出靶值(原值均值)和测定值（稀释后样本均值M×5），计算检测值与靶值的相对偏倚（%）。偏倚=[（测定值-靶值）/靶值]×100%。

2 结果

2.1 分析灵敏度验证结果 10次S0发光值均值为178788，SD 为 54025，均值+2SD 为 286838，得出最低检测限即分析灵敏度为5.81ng/ml。

2.2 精密度验证结果 分析内精密度验证结果为低、高值样品（CV%）分别为6.31%和5.65%；分析间精密度验证结果为低、高值样品（CV%）分别为6.46%和8.09%。均小于厂商提供的数据 （不大于10%）。见表1。

2.3 线性范围验证结果 选取IGF-1高浓度（839.653ng/ml）和低浓度（54.548ng/ml）血清，稀释后的理论值和实测均值见表2，散点图见图1，结果显示 Y=1.027X-50.77，R2=0.9929。 b=1.027 在0.97～1.03 范围内，R2≥0.9900， 故 IGF-1 浓度在15～1000ng/ml范围内线性良好。

表1 精密度实验验证结果（ng/ml）

表2 线性范围验证（ng/ml）

2.4 回收实验验证结果 将高低值血清样本按比例混合后上机检测，根据检测值和理论值计算回收率R为105.70%，见表3。

表3 回收率验证（ng/ml）

2.5 干扰实验验证结果 TBil浓度高达150umol/L、TG浓度高达12mmol/L时，测定的IGF-1高、低水平样本的干扰值均在干扰限度值 （1.96s）范围内，均不构成干扰。而Hb低于5g/L时使IGF-l的浓度明显下降。

图1 IGF-1线性分析

2.6 参考区间验证结果 原值两次测定结果均值为737.5645ng/ml稀释样本两次测定结果均值为140.8105ng/ml，偏差为-4.54%，符合标准要求：偏差不大于±20%，试剂盒参考范围可满足15～5000ng/ml的要求。

3 讨论

IGF是一类既有胰岛素样合成代谢作用，又有促生长作用的单链多肽，血中90%的IGF-1由肝脏合成。目前发现，IGF有IGF-1和IGF-2两种。IGF-1是GH依赖的生长因子，IGF-1作为一个重要的有丝分裂原，在机体中的主要作用是促进细胞的生长分化，而IGF-2是重要的胚胎生长和发育调节因子，GH的大部分生物学效应是由肝、肾等组织依赖所产生的IGF-1介导[10，11]。生后随年龄的增长，IGF-1水平缓慢升高，直到青春发育前大致与成人相似，青春发育期IGF-1水平急剧升高，为成人水平2倍以上，持续几年后下降，18岁以后达成人水平，50岁后呈缓慢下降的趋势[12，13]。因此，临床工作中常常用血清IGF-1水平来协助诊断生长激素缺乏症，或对使用生长激素治疗的儿童进行用药的安全监测和疗效评估。

磁微粒化学发光法检测IGF-1的原理是采用双抗体夹心法。用抗人IGF-1抗体包被于酶标板上，实验时标本或标准品中的IGF-1会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IGF-1抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人IGF-1抗体与结合在包被抗体上的人IGF-1结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入发光底物混合液，发光底物在辣根过氧化物酶的催化下发出荧光，用化学发光免疫分析仪测定化学发光值（RLU），IGF-1浓度与化学发光值之间呈正相关，通过绘制标准曲线求出标本中IGF-1的浓度。

任何分析方法都存在一定的误差，为保证高质量的临床实验室服务，对选定的方法经过初步试验之后或用于临床常规检测之前以及在对原有检测系统进行修改后，实验室须对该方法进行严格、系统的技术性能评价或对厂家所提供的技术性能指标进行验证[14]。美国病理家学会(CAP)要求申请认可的实验室在开展新检测项目前，需要根据本实验室条件对厂家提供的性能参数进行验证方可使用[15]，为此CLSI出台了一系列EP指南文件，本研究根据相应的EP文件进行评价，EP5-A2为定量测量方法的精密度性能评价方案，是目前评价测量方法精密度最全面、最具统计学效能的方法；EP7-A2为临床化学干扰试验-批准指南，其干扰筛选方案是目前较为常用的方法；EP6-A2为定量测量方法的线性评价方案是多项式评价方法中具有代表性的方法[16]。方法学验证最重要的指标是准确度和精密度。本研究通过回收实验验证准确度，计算平均回收率R为105.70%，符合标准要求。本实验中黄疸和脂血抗干扰能力较强，而溶血状态抗干扰能力较弱，建议在临床报告结果中注明标本存在的可能干扰因素，提醒临床注意。精密度是检测系统的主要分析性能之一，更是其他性能评价的基础。精密度是体现重复性的重要性能指标，本研究结果显示，磁微粒化学发光测定IGF-1的低、高值混合血清分析内精密度CV分别为6.31%和5.65%，分析间精密度CV分别为6.46%和8.09%，均符合标准要求：不大于15%。线性范围验证的目的是验证该方法的最高检测值和高、低检测值之间是否呈线性关系，其评价有助于发现仪器、校准品、试剂和操作规程等方面的误差来源，本研究通过系列比例稀释，检测IGF-1水平，验证对数据进行多项式回归分析，通过目测图1可看出多项式的拟合曲线近为重合，所有数据几乎均落在一条直线上，初步判断最佳的拟合形式为直线，且数据的精密度较高，证实在该浓度范围内稀释的几个点为直线方程，结果表明实测浓度与理论浓度之间相关性良好，R2为0.9929。

综上所述，通过对IGF-1的分析灵敏度、分析精密度、线性范围、回收率、干扰实验和参考范围的评价和分析，证实AutoLumo A2000检测系统应用磁微粒化学发光免疫分析技术测定IGF-1的灵敏度高、精密度好、结果准确可靠，性能可满足临床检测的要求。