Wnt3a、SFRP1、NLRP3及IL-1β联合检测对慢性牙周炎感染的诊断价值分析

赵芳，黄婷，李娟

(郑州市第一人民医院口腔科，河南 郑州 450000)

流行病学研究显示，慢性牙周炎的发病率具有进一步的上升趋势[1]。临床上慢性牙周炎的发生发展能够导致牙周袋的形成，促进牙齿的松动，增加失牙的风险。不同的生物学因子特别是炎症相关因子的表达，能够通过影响成纤维细胞的凋亡，降低结缔组织的张力及支持功能，促进慢性牙周组织的炎症性疾病的发生。Wnt[2]信号通路的激活能够通过维持局部自身免疫因子的表达，提高局部牙周组织的抗炎症损伤能力；分泌型卷曲相关蛋白 1(secreted frizzle.relatedprotein 1，SFRPl)的表达能够通过调控Wnt3a信号通路的激活，从而抑制Wnt3a信号通路的上调，提高下游单核细胞或者巨噬细胞对于牙周组织的浸润[3]；不同的炎性小体均能够影响到组织损伤的发生过程，而其中炎症小体（NLRP3）近年来被认为显著影响到了口腔炎症性疾病的发生过程，NLRP3的上升能够导致牙周组织细胞的膜完整性的破坏，导致牙周支持结构的破坏，导致慢性牙周损伤[4，5]。为了进一步揭示 Wnt3a、SFRP1、NLRP3 及 IL－1β 等在慢性牙周炎中的表达情况，从而为慢性牙周炎的早期诊断提供依据，本次研究选取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作为研究组，探讨了相关指标的表达及其与患者病情的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作为研究组，男 42 例，女 48 例，年龄 25～50 岁，平均(33.85±3.14)岁。按其附着丧失(CAL)程度将患者分为轻中重3个等级。另选取该时段来我院体检的90例健康者作为对照组，其中男33例，女57例，年龄25～50 岁，平均(30.17±3.82)岁。

纳入标准：①经检查确诊为慢性牙周炎感染的患者；②半年内未服用过抗生素、免疫抑制剂药物者；③患者及家属知情同意并配合治疗。

排除标准：①合并糖尿病、类风湿等全身性系统疾病者；②长期吸烟酗酒者；③合并恶性肿瘤、严重心肝肾疾病的患者；④月经、妊娠或哺乳期妇女；⑤精神病患者。

1.2 检测方法 酶联免疫吸附法检测Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 的含量：采集齿龈沟液体 3ml，加入 Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 单抗，标本和标准品中的Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 会与单抗结合，PBS液体洗涤5min。按照1：500的比例加入羊标志的一抗5ml，4℃放置过夜，PBS缓冲液洗涤3 次，每次 5min，加入鼠来源的二抗（1：1000）2ml，室温放置2h，PBS液体洗涤5min。加入显色底物，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值。

采用RT－PCR检测Wnt3a水平：在提取液体中加入 0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)，反复一次洗涤 RNA，弃上清，在管底部可见一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC 使其终浓度均为 20pmol/ul，制备反应体系，RT－PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共40个循环；循环完毕后68℃延伸7min。

1.3 统计学分析 选用统计学软件SPSS 16.0对研究数据进行分析和处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）进行统计描述，计数资料采用 χ2检验；组间比较采用t检验；P值＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组牙周组织中Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的表达水平比较 与对照组相比，研究组Wnt3a的mRNA 表达显著下调（0.41±0.02），差异有统计学意义 （P＜0.05）。研究组Wnt3a蛋白表达显著下调（0.39±0.28），差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1。

表1 两组牙周组织中Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的表达水平比较

2.2 不同CAL程度患者SFRPl的浓度比较 与对照组相比，除轻度牙周炎患者外，中、重度患者的SFRPl浓度均明显升高，差异有统计学意义 （P＜0.05）。 见表 2。

2.3 两组牙周膜细胞中NLRP3及IL－1β的表达比较 与对照组相比，研究组牙周膜细胞中NLRP3和 IL－1β 表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 不同CAL程度患者SFRPl的浓度比较

表3 两组牙周膜细胞中NLRP3及IL-1β的表达比较（pg/ml）

3 讨论

现阶段临床上慢性牙周炎的发生率具有显著的上升趋势，特别是在合并有糖尿病、高血压或者自身免疫性疾病的人群中，慢性牙周炎的发病均具有进一步的上升趋势。临床上慢性牙周炎的发生能够增加患者远期牙周组织的破坏和牙齿脱落的风险[6]。但慢性牙周炎的早期诊断水平较低，临床早期多不具有显著的临床症状，诊断较为困难，口腔内镜检查等的费用偏高且难以广泛开展。血清学指标的检测在感染性疾病的诊断过程中发挥了重要的参考作用，其检测较为方便、经济，可开展性较高、容易普及。本次研究的现实意义在于：⑴能够为临床上慢性牙周炎患者的早期诊断提供血清学参考指标；⑵能够为临床上慢性牙周炎的生物学治疗提供理论基础。

Wnt3a信号通路的激活能够提高局部分泌型IgA的浓度，提高局部抗氧化或者抗病原体侵蚀的能力，特别是Wnt3a蛋白的表达上升能够增加其巨噬细胞吞噬厌氧菌或者牙菌斑微结构的能力，促进病原体的清除[7]；SFRP1作为Wnt3a信号通路上重要的效应因子，SFRP1的表达浓度的改变能够拮抗Wnt3a的下游因子的激活作用，降低Wnt3a对于局部牙龈沟中液体微环境的保护作用[8]；NLRP3及IL－1β均是炎症因子相关成分，NLRP3及IL－1β的表达上升能够提高局部炎症因子的富集程度，促进局部趋化因子或者补体成分的激活，增加中性粒细胞酶对于牙周组织的分解作用，增加炎症细胞对于牙周组织的浸润[9，10]。部分研究已经探讨了Wnt3a信号通路上部分因子在慢性牙周炎局部齿龈沟中的表达情况，认为相关指标的异常表达是促进病情进展、导致牙周组织破坏的重要因子，但对于SFRP1、NLRP3及IL-1β等的分析研究不足。

本次研究通过齿龈沟或者牙周组织细胞中的相关因子的表达分析发现，Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白在齿龈沟或者牙周组织细胞中的表达浓度均明显上升，高于正常良性牙周组织，差异具有统计学意义，提示Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的异常表达可能影响到了慢性牙周炎的发生过程，相关指标的高表达能够通过影响Wnt3a信号通路的调控，促进慢性牙周炎的发生[11-13]：⑴Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的下降失去了对于下游游离状态的体液因子的促释放作用，导致牙周组织的自身抗凋亡能力的下降；⑵Wnt3a信号通路沉默导致的局部微环境的改变，能够增加牙菌斑的形成风险，增加牙周组织成纤维成分的分解速度。程焕芝等[14]研究者在探讨了72例慢性牙周炎患者的齿龈沟中的相关因子的表达后发现，Wnt3a蛋白阳性表达率平均下降25%以上，同时患者的慢性牙周炎的病程越长、牙周组织的破坏越为严重，Wnt3a蛋白的下降越为明显。附着丧失是评估慢性牙周炎患者病情严重程度的重要指标，在附着丧失越为严重的患者中，SFRPl的表达浓度上升越为明显，提示了SFRPl与慢性牙周炎患者的病情密切相关，SFRPl能够通过影响局部牙周组织中的金属蛋白酶的活性，实现对于患者牙周炎组织的破坏作用，提高牙周组织的分解及牙齿的破坏。采集病变较为明显的牙周炎组织患者的病灶，检测蛋白水平的表达，发现牙周膜细胞中NLRP3及IL-1β的表达浓度明显上升，二者是评估患者体内局部炎症反应程度的指标，牙周膜细胞中NLRP3及IL-1β的表达上升提示了炎症小体或者炎症介质在慢性牙周炎病情进展过程中的重要作用。但部分学者并不认为IL-1β的高表达具有普遍性，IL-1β的高表达主要与疾病的急性发作、牙龈短期内破坏加剧、牙龈萎缩、牙槽骨的分解和侵蚀等过程有关[15]。

综上所述，慢性牙周炎患者感染可引起牙周组织中Wnt3a蛋白表达下调，龈沟液中的SFRPl含量升高，牙周膜细胞中NLRP3及IL-1β表达上调，说明 Wnt3a、SFRP1、NLRP3 及 IL-1β 可能在促进慢性牙周炎患者的病情进展过程中发挥了重要的调控作用。