南昌地区RhD阴性献血者DEL型检测及分析

张莹莹，余真强，熊建平，陈火玲，杜忻，徐晶

(南昌市中心血站，江西 南昌330025)

DEL型作为RhD血型中的一种特殊变异体，其输血安全性一直存在争议。已有研究学者提出将DEL型从RhD阴性献血者中筛选出来，避免产生同种异体免疫[1，2]。在中国，阴性人群中DEL型占有较高的比例，且遗传学背景非常复杂，DEL型的准确鉴定对确保阴性患者的临床输血安全具有重要的指导意义[3－5]。为调查南昌地区RhD阴性献血者中DEL表型分布以及与各地DEL型表型分布进行比较，本课题应用酸吸收放散及PCR－SSP实验方法从RhD阴性献血者中筛查DEL表型并进行基因分型，为制定南昌地区DEL型输血策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2017年2月至2018年1月南昌市中心血站RhD阴性献血者样本，共计107例。

1.2 试剂与仪器 抗－A、抗－B试剂、ABO红细胞、抗体筛选细胞 （上海血液生物医药有限责任公司）；抗－AB 试剂（法国 DIAGAST）；凝聚胺试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司)；IgM型单克隆抗－D试剂、IgG型单克隆抗－D试剂 (上海血液生物医药有限责任公司)；IgM+IgG型单克隆抗－D试剂(英国Millipore（UK）Ltd)；人源抗－D 血清(我站自制，抗体效价＞256)；抗－C、抗－c、抗－E、抗－e 单克隆抗体检测试剂（上海血液生物医药有限责任公司）；酸吸收放散试剂（广州展全生物科技有限公司）；引物、DNA 提取试剂盒（Innotrain）；Taq 酶（Promega）；久保田离心机（KA－2002）；GRIFOLS 离心机（DGTherm）；GRIFOLS 孵 育 器 （DGSpin）；PCR 扩 增 仪（SimpliAmp）；凝胶成像仪（G：BOX F3）。

1.3 方法

1.3.1 RhD阴性确认 对盐水法初筛为RhD阴性的样本用抗人球蛋白法确认，并进行C、c、E、e抗原分型。

1.3.2 酸吸收放散 将确认为RhD阴性的样本取200μl红细胞，洗涤3次制成压积红细胞，加入等体积人源－D，混合均匀，37℃水浴30min，洗涤6次制成压积红细胞，将等体积酸放散试剂加入吸收红细胞，迅速混匀离心，3400r/min，离心1min，取放散液100μl，将pH调节剂滴入放散液调至中性，加入50μl O型RhD阳性红细胞，37℃水浴1h，用微柱凝胶方法检测放散结果。

1.3.3 PCR－SSP 将酸吸收放散阳性的 5 例 DEL 型样本送至广州血液中心，通过PCR－SSP方法进行RhD基因检测。

1.4 统计学分析 应用SPSS 21.0统计软件对数据进行卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhD阴性献血者表型分布 107例RhD阴性献 血 者 中 ccee 53 例 （49.53% ），Ccee 37 例（34.58% ），CCee 11 例 （10.28% ），CcEe 3 例（2.80%），ccEe 3 例（2.80%）。

2.2 中国各地区RhD阴性献血者DEL型分布特征 107例阴性献血者中检出DEL型30例（28.04%），与上海地区比较差异有统计学意义（χ2=6.02，P＜0.05），与其它地区比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

表1 南昌与各地RhD阴性献血者DEL型分布比较

2.3 DEL型献血者表型分布 检出DEL型30例，占比为 28.04%，其中 Ccee 23 例（76.67%），CCee 7例(23.33%)，与各地区DEL型献血者表型分布无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

表2 南昌与各地DEL型献血者表型分布比较

2.4 PCR－SSP基因分型结果 5例DEL型标本第9外显子均有1227G＞A突变，其中杂合子4例，纯合子1例，见图1。

图1 PCR-SSP基因分型结果

3 讨论

RhD是继ABO血型系统之后最重要的血型系统，在临床输血、自身免疫性溶血以及新生儿溶血中有着重要意义[10－12]。DEL型作为特殊的RhD变异体，其重要性受到广泛关注。本研究显示，在南昌地区的107例RhD阴性献血者中30例为DEL型，占 28.04%，除与上海（P＜0.05）地区存在统计差异外，与其它地区无统计学差异。DEL型在南昌地区RhD阴性献血者中占比较高，因此深入研究DEL型对提高临床输血安全性具有重要意义。

本研究的30例DEL型样本中，RhCE表型主要为 Ccee（76.7%）和 CCee（23.3%），与浙江、上海、台湾和福州的研究结果相似 （P＞0.05），说明DEL型与Ce单倍体关系密切，可能与RhD基因和RhCe 基因紧密连锁有关[13－16]。

对于RhD阳性个体来说，至少拥有一条正常RHD基因，RhD阴性个体的主要分子机制在于RHD基因的完全缺失，而DEL表型形成的主要分子机制为RHD基因1227G＞A突变。PCR－SSP结果显示5例标本第9外显子均有1227G＞A突变，其中4例纯合子，1例杂合子，说明RhD 1227A是南昌地区DEL表型个体的重要遗传标记。

在中国，DEL型在RhD阴性人群中占比较高，且一直将DEL当作RhD阴性用于临床输血。而在国内外均有RhD阴性受血者输注DEL型红细胞产生抗－D同种免疫的文献报道[17－20]。因此，增加样本量、调查DEL型分布特点、进一步揭示DEL型遗传背景以及基因多态性，对提高临床输血安全性具有重要意义。