红三叶新品系生理生化指标对低温的响应机理

杨 丹， 田新会， 杜文华

(甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 中-美草地畜牧业可持续研究中心， 甘肃 兰州， 730070)

植物的抗寒性是指对低温做出应激反应的一种生理特性，受遗传和环境的综合影响。在低温条件下，植物生理生化和组织刺激的反应机制包括对外界刺激的感受、信号的放大、传输及应答，从而引起相应的生理指标变化[1]。近年来，国内外学者在植物抗寒性生理特性方面研究较多，而且聚焦于培育和选择抗寒性强的作物来提高农业经济效益[2]。

随着外界环境温度的变化，植物体内的代谢和生理活动都会随之发生改变，而这些生理代谢活动都是在水的参与下进行的。因此，植物在低温条件下的水分变化情况，可作为检验植物抗寒性的重要内容之一[3]。叶绿素含量(Chlorophyll，CHL)在低温胁迫下的变化情况，在一定程度上反映植物光合作用的变化规律，即植物对低温胁迫的敏感性[4]。可溶性糖(Soluble Sugar，SS)是植物体内重要的渗透调节物质和代谢产物，在植物抗寒性研究中一直被广泛关注，可溶性糖含量越高植物的抗寒性越强，反之则越弱。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)作为细胞质膜过氧化的主要产物，在低温条件下，抗寒性强的品种丙二醛含量低于抗寒性弱的品种[5]。叶片超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)被称为植物体内消除氧自由基的保护酶系统，可作为抗寒性评价关键指标。这3者在机体抵御胁迫损伤时相辅相成，共同发挥着保护作用，使植株免受或少受活性氧伤害[6]。

红三叶(Trifoliumpratense)又称红车轴草、红荷兰翘摇等，其营养丰富，蛋白质含量高，含有家畜所需的多种氨基酸及维生素，草质柔软，适口性好，家畜喜食。红三叶适宜在温暖湿润的环境下生长，超过最适气温(15～25℃)都会使其生长受到影响[7]，并直接影响其越冬性和翌年生物产量。崔英[8]和王晓军[9]把几项生理生化指标结合起来，对不同红三叶品种的抗寒性进行了研究，鉴定了不同红三叶品种抗寒性强弱。目前，国内对红三叶耐低温性方面的研究较少。孔令慧[7]以4℃低温胁迫12 h为周期，对4个红三叶材料的生理指标进行测定，结果表明，处理的时间越长，叶片含水量和叶绿素含量下降的程度也越大，但是相对膜透性、MDA含量及SOD，POD和CAT酶活性随着低温处理时间的延长而升高。本研究拟通过人工模拟4℃低温环境，在孔令慧研究的基础上，将低温胁迫时间延长至21 d，以研究甘肃农业大学利用澳大利亚红三叶品种Sensation和Renegade有性杂交培育红三叶新品系的耐低温性，旨在为红三叶新品种培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为甘肃农业大学利用澳大利亚红三叶品种Sensation和Renegade有性杂交，经无性繁殖得到的红三叶新品系(R)，对照品种岷山红三叶(CK1)和甘红1号红三叶(CK2)为国家审定登记的适宜于甘肃省种植的红三叶品种。

1.2 试验方法与设计

试验于2017年4月7日在甘肃农业大学伏羲堂进行。取新鲜土壤与砂土按1:1比例进行均匀混合，装入直径22 cm，深15 cm的花盆中，分别选取籽粒饱满的红三叶新品系、甘红红三叶和岷山红三叶种子各40粒种入花盆中，每个花盆种10粒，每个材料重复4次，放入光照培养箱(温度20℃，光照20 h)，定期浇水，待红三叶材料长出第5片叶片后，从每个花盆中随机取5片新鲜叶片以备测定生理生化指标，作为第0 d数据。调节光照培养箱温度为4℃，进行耐低温性试验[7]，分别于第7 d，14 d和21 d随机选取3～5 g的新鲜叶片[10]，测定相应的生理生化指标。

1.3 测定指标与方法

叶片含水量采用烘干法测定，叶绿素含量采用丙酮反复提取法测定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定，叶片超氧化物歧化酶用氮蓝四唑法测定，过氧化物酶采用愈创木酚法，过氧化氢酶采用紫外吸收法测定。以上各指标的测定参考植物生理学实验指导[11]和植物生理学实验分析测定技术[12]进行。

1.4 数据统计

采用EXCEL2010对参试红三叶材料间，低温胁迫天数间及红三叶材料与低温胁迫天数交互作用间的数据求平均值并进行数据整理和做图，利用SPSS19.0进行方差分析，有显著或极显著差异时用DUNCAN法进行多重比较。

1.5 综合评价

(1)用以下公式对各红三叶材料各性状的具体函数值进行计算：

(1)

(2)

上式中，Uij为i材料的j性状的隶属函数值，Xij为i材料的j性状值，Xjmin为各红三叶材料j性状的最小值，Xjmax为各红三叶材料j性状的最大值。当j性状与植物的耐低温性成正相关时，用(1)式；当j性状与植物耐低温性成负相关时用(2)式。

(2)把每个红三叶材料各个性状的具体耐低温隶属值进行累加，并求出平均值:

(3)

上式中，Ui为i材料的耐低温隶属函数平均值，Ui越大，耐低温性越强；反之越小[13]。

2 结果与分析

F测验(表1)表明，供试红三叶材料间，除LWC无显著性差异外，MDA含量和CAT活性的差异显著(P<0.05)，CHL、SS含量及POD和SOD活性的差异极显著(P<0.01)；低温胁迫天数间，除CHL含量和MDA含量的差异显著外(P<0.05)，其他测定指标的差异极显著(P<0.01)；红三叶材料与低温胁迫天数交互作用间，SS含量及CAT和POD活性的差异显著(P<0.05)，LWC、CHL含量、MDA含量及SOD活性的差异极显著(P<0.01)。需对上述存在显著或极显著的指标进行多重比较。

表1 红三叶材料间、低温胁迫天数间及红三叶材料低温胁迫天数交互作用间叶片含水量、叶绿素、 可溶性糖、MDA、POD、SOD、CAT的方差分析Table 1 Analysis of variance of content of leaf water,chlorophyll,soluble sugar,MDA,POD,SOD and CAT in red clover leaf

注：*表示差异达显著水平(P<0.05)；**表示差异达极显著水平(P<0.01)。下同

Note:*indicated significant difference at the 0.05 level;** indicated significant difference at the 0.01 level. The same as below

2.1 红三叶材料间生理生化指标的差异

如表2所示，3份红三叶材料中R的叶绿素含量最高，其次为CK1，CK2的叶绿素含量最低，且3者均存在显著性差异(P<0.05)；可溶性糖含量显著低于CK1和CK2；MDA含量最高，与2对照材料有显著差异(P<0.05)，CK2的MDA含量最低，CK1居中；SOD活性显著高于CK1和CK2(P<0.05)，CK1的SOD活性略低于CK2，但无显著差异；POD活性最高，其次为CK1，CK2最低，3者间均存在显著性差异(P<0.05)；CAT活性显著高于CK1和CK2(P<0.05)，CK1的CAT活性略高于CK2，且2者间无显著差异。

2.2 低温胁迫天数间红三叶材料生理生化指标的变化

由表2可知，供试红三叶材料的叶片含水量和叶绿素含量，随着胁迫天数的增加而逐渐降低，且胁迫处理后均显著低于第0 d(P<0.05)，胁迫第21 d时达到最小值，与其他各处理天数间存在显著性差异(P<0.05)；不同胁迫天数间，供试红三叶材料的可溶性糖含量和MDA含量均存在显著性差异(P<0.05)，且总体变化趋势一致，即随着胁迫天数的增加，2者均不断上升，胁迫第21 d时达到最大值，且显著高于其他处理(P<0.05)；叶片SOD，POD和CAT活性，随着低温胁迫天数的增加，呈先升高后下降的变化趋势，且均在胁迫第14 d时达到最大值。

2.3 红三叶材料×低温胁迫天数交互作用间生理生化指标的差异

LWC：各处理间供试红三叶材料的叶片含水量显著性如图1(a)所示。正常处理下R的叶片含水量最高，且与CK2存在显著性差异(P<0.05)；随着低温胁迫时间的增加，3种红三叶材料的叶片含水量变化程度均不相同，除第14 d红三叶新品系R的叶片含水量显著低于CK1和CK2外(P<0.05)，其他处理中，R与CK2间均无显著差异，但显著低于CK1(P<0.05)。

CHL含量：由图1(b)可知，对照处理下，R的叶绿素含量显著高于CK1和CK2(P<0.05)；随着低温胁迫时间的延长，红三叶材料的叶绿素含量呈下降趋势，第7 d和21 d时R的叶绿素含量显著高于2对照，14 d时显著低于CK1，但显著高于CK2(P<0.05)

表2 红三叶材料间、低温胁迫天数间的生理生化指标的差异Table 2 The difference between the number of physiological and biochemical indexes of red clover materials, low temperature stress

注：同一指标同列不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note:Different letters within the same row for the sameparameter mean significant difference at the 0.05 level

图1 红三叶材料×低温胁迫天数交互作用间叶片含水量和叶绿素含量的差异Fig.1 Differences of leaf water content and chlorophyll content in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days注：不同柱形图间不同字母表示差异显著。下同Note:Different letters among different bars mean significant difference at the 0.05 level. The same as below

SS含量：各处理间供试红三叶材料的差异如图2(c)所示。在正常条件下，R的可溶性糖含量显著低于CK2(P<0.05)，但与CK1无显著性差异；随着低温胁迫时间延长，7 d时R的可溶性糖含量显著低于CK1和CK2(P<0.05)，14 d时其可溶性糖含量显著高于CK1和CK2(P<0.05)；21 d时R的可溶性糖含量显著低于CK1(P<0.05)，与CK2无显著性差异。

MDA含量：由图2(d)可知，在常温(0 d)和低温胁迫7 d时，R的MDA含量均显著高于2对照材料；14 d时，R的MDA含量显著低于CK1，但显著高于CK2(P<0.05)；21 d时，R的MDA含量与CK1无显著差异，但显著高于CK2(P<0.05)。

SOD活性：对照处理下，R的SOD活性最低，但与2对照材料不存在显著性差异；低温胁迫7～21 d时，R的SOD活性均高于CK1和CK2；7 d时与CK2无显著差异，但显著高于CK1；14 d时与2对照均无显著差异；21 d时显著高于2对照(P<0.05)(图3)

POD活性：无论是常温还是低温胁迫，R的POD活性最高，且显著高于2对照材料(P<0.05)，CK2的POD活性最低，CK1居中。(图3)

CAT活性：各处理间供试红三叶材料的显著性如图3(g)所示。无论是常温还是低温胁迫处理，R的CAT活性均显著高于CK1和CK2(P<0.05)。

图2 红三叶材料×低温胁迫天数交互作用间叶片可溶性糖含量和丙二醛含量的差异Fig.2 Differences of soluble sugar content and malondialdehyde content in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days

图3 红三叶材料×低温胁迫天数交互作用间叶片SOD，POD和CAT活性的差异Fig.3 Differences of the SOD,POD and CAT activities in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days

2.4 不同红三叶材料耐低温性综合评价

植物在受到逆境胁迫后，受多种因素的影响[8]。仅依据单项指标不能准确地评价参试红三叶材料的耐低温性强弱。故本试验采用模糊隶属函数法对参试红三叶材料的LWC，CHL，SS，MDA含量及SOD，POD和CAT活性7项指标进行耐低温性隶属函数值计算(表3)，并通过耐低温性综合分析对其进行排序。结果表明，3份供试红三叶材料的耐低温性强弱为R > CK1 > CK2。

表3 不同红三叶材料的抗寒隶属函数值及耐低温性排序Table 3 Subordinate function values of low temperature resistance and order for different red clover materials

3 讨论

抗寒性鉴定是牧草种质资源评价的重要内容之一。植物的抗寒性由其遗传特性决定的，是植物长期处于低温寒冷环境的过程中，通过本身的遗传变异和自然选择获得的一种抗寒能力。不同植物抗寒性不同，甚至同一植物不同器官的抗寒性也不一样[14]。抗寒性强的植物其LWC含量较低，CHL含量下降的幅度较小，有利于植物对低温环境的适应性[15]。抗寒性强的苜蓿品种在低温条件下能够维持较高的SOD，POD和CAT活性[16]。刘瑞媛[17]研究表明，不同甜高粱均具有一定的抗寒性但其抗寒能力有一定差异。本试验结果表明，红三叶新品系的LWC最低，CHL含量及叶片SOD，POD和CAT活性最高，CK1的LWC最高，CK2的SS含量最高，说明在低温胁迫条件下不同红三叶材料的各项生理指标表现不一致(表2)，用单一指标难以衡量其耐低温性强弱。

本研究得出，低温胁迫21 d时供试红三叶材料的LWC显著低于胁迫前，说明植物的耐低温性和植物的LWC之间存在着紧密联系。温度是制约酶活性高低的重要因子之一，当低温胁迫超过植物体所能承受的能力时光合作用就会受到不可逆伤害，光合作用色素含量也会明显减少[18]，本研究得出，随着低温胁迫程度的加剧，参试红三叶材料的CHL含量显著降低，这与王宁[19]的研究结果一致，说明低温胁迫不但让植物体叶片叶绿素合成受阻，还会造成叶片叶绿素降解速度的升高，最终使植物叶片CHL含量下降。申晓慧[20]研究得出，抗寒性强的苜蓿材料在冬季最冷月时，SS含量高于其他品种。赵一鹤等[21]研究表明，随着低温胁迫时间的延长，3个甜角品种幼苗叶片的LWC呈下降趋势，MDA含量，Pro含量和SS含量呈上升趋势。老麦芒和巴旦杏受到低温胁迫SS含量上升，细胞膜受损伤程度加深[22-23]。本研究得出，随胁迫时间的延长，供试红三叶材料的MDA含量和SS含量均呈上升趋势，说明受低温胁迫影响，中间产物自由基和MDA，与细胞内各种成分发生强烈地反应，因而引起对酶和膜的严重伤害，导致膜的结构、生理完整性及许多生物功能分子的破坏；而SS不但可以提高细胞的渗透浓度，降低水势，增加植株的持水能力，同时还可以作为冰的保护剂对原生质体和线粒体起保护作用，对提高植物的耐低温性具有重要作用[24]，这也与前人[21-23]研究结果相符合。

SOD和POD共同作用，将有毒的自由基活性氧还原成水和氧分子，CAT对线粒体和膜脂过氧化产生的活性氧有清除作用。这 3种保护性酶与植物抗寒性密切相关，已被研究所证明[6]。本试验结果表明，随着低温胁迫时间的延长，红三叶叶片的SOD，POD和CAT活性均表现出先升高后下降的趋势。是因为细胞中的保护酶系统SOD，POD和CAT通过酶活性的增强，来清除体内有害物质，使细胞免于伤害或抗性加强[22]。这说明适度低温胁迫对红三叶具有抗寒锻炼的效果，但长期重度低温胁迫则会使植物酶失活，活性降低。

从红三叶材料与低温胁迫天数间的交互作用而言，随着低温胁迫时间的延长，供试红三叶材料的LWC呈下降趋势，并在胁迫21 d时达到最小值。但各材料的变化幅度不同，红三叶新品系的LWC降幅较大，表明在低温条件下该品系通过降低体内组织含水量，减少了低温结冰带来的伤害[25]。陈代慧等[24]发现，胁迫天数相同时，抗寒性强的山茶花品种CHL含量下降程度要小于抗寒性弱的品种。刘雨诗[26]也认为抗寒性强的紫花苜蓿拥有更高的CHL含量。本研究发现，无论是常温还是低温胁迫，红三叶新品系R的CHL含量均显著高于CK2，说明红三叶新品系的耐低温性较强，这与刘雨诗[26]的研究结果一致。根据参试红三叶材料在低温胁迫第14 d的MDA和SS含量的变化，红三叶新品系的MDA含量显著低于2对照材料，而SS含量显著高于2对照材料，随着胁迫时间的延长至21 d时，CK1的SS含量最高，CK2的MDA含量最低，表明参试红三叶材料在不同胁迫天数下生理指标的变化各异。

从整个胁迫天数来看，3份红三叶材料叶片的SOD，POD和CAT活性总体呈先升高后下降的变化趋势，且红三叶新品系R的3种酶活性均显著高于2对照材料，说明在短期低温胁迫下，参试红三叶材料产生应激反应，体内SOD，POD和CAT活性增大，以维持细胞膜的稳定性和完整性，抵御逆境，以减轻低温对植物造成的伤害，但随着低温胁迫程度的加剧，膜系统受到的伤害越来越严重，致使细胞内的各种代谢出现紊乱，SOD，POD和CAT活性又开始下降，这表明植物抗氧化保护系统的抵抗修复能力有一定阈值[10]。

在红三叶生长发育过程中，不同材料的耐低温机制可能不同，因此，为了客观评价3份红三叶材料的耐低温性，需从多个指标进行综合考虑，而隶属函数分析则能满足这一需求，故本试验采用隶属函数法进行分析，结果表明R耐低温性强于CK1和CK2。

4 结论

3个参试材料中，新品系R的LWC和SS含量最低，CHL含量，MDA含量及叶片SOD，POD和CAT活性最高。随着低温胁迫时间的延长，供试红三叶材料的LWC和CHL含量逐渐降低，MDA含量和SS含量则逐渐升高，叶片中SOD，POD和CAT活性均呈先升高后下降的变化趋势。从红三叶材料×低温胁迫天数交互作用而言，R的CHL含量显著高于CK2，SS含量及叶片SOD，POD和CAT活性均显著高于2对照材料。基于隶属函数法的综合评价表明，红三叶新品系R耐低温性最强，其次为岷山红三叶，甘红1号红三叶的耐低温性最差。