东北自然发酵酸菜中耐低温优良乳酸菌菌种的筛选

张晓黎 吴兴壮 高雅

摘要：在10 ℃低温状态下，利用分离得到的乳酸菌菌种开展应用试验。接种白菜进行发酵，在发酵过程中分别测定菌种产酸速度、产酸量、降解亚硝酸盐能力和乳酸菌素产量，以成品酸菜风味为最终考核指标，筛选出2株产酸速度快、耐酸强、降解亚硝酸盐能力强、乳酸菌素产量高的耐低温乳酸菌菌株。

关键词：酸菜;乳酸菌;菌种筛选;耐低温

中图分类号：TS201.3   文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2018）05-0020-03

乳酸菌是酸菜發酵过程中起主要作用的微生物菌群，其生物学特性和发酵特性直接影响着酸菜的发酵效果。采用低温乳酸菌发酵生产酸菜，可以获得酸味柔和、风味饱满的酸菜。乳酸菌作为中温型微生物，一般在低于15 ℃的条件下生长缓慢，在10 ℃以下生长微弱、甚至很难生长。目前酸菜工业化生产所应用的乳酸菌菌种多数为常温下分离所得，适宜的发酵温度为22～30 ℃，低于10 ℃其生长受到抑制。在东北地区，发酵酸菜所用的大白菜大多在10月中下旬大量采收，此时外界气温一般已经降到15 ℃以下，最低气温甚至达到0 ℃左右。采用人工接种乳酸菌生产酸菜，必须人为提高生产环境温度，才能充分发挥乳酸菌菌种优势，导致能源消耗大、生产成本高。因此，目前东北地区的酸菜生产以自然发酵为主，发酵过程中除了乳酸菌外还有其他微生物同时繁殖生长，为了防止酸菜产品涨袋，往往需要人为添加防腐剂，产品质量无法保证，对酸菜产业良性发展极为不利。

本课题以东北农家低温自然发酵酸菜中分离、鉴定的乳酸菌菌种为研究对象，经过驯化筛选获得性能优良的耐低温乳酸菌菌种，为低温环境条件下规模化生产酸菜提供可靠、便捷的乳酸菌菌种，可以缩短低温环境条件下酸菜生产周期，提高生产效率，降低生产成本，且充分发酵后产品无需添加防腐剂，确保产品品质和食用安全性，为乳酸菌发酵酸菜规模化生产提供了有效的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 乳酸菌菌种 L1，L2，L3，L4，L5：从低温自然发酵酸菜中分离鉴定保存的耐低温乳酸菌菌种。

1.1.2 培养基配方 MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸馏水至1 000mL，调节pH值为6.5，121 ℃下灭菌20 min。酸菜生产种培养基：200 g白菜，50 g白糖，加水1 000 mL，水烧开后小火煮30 min，然后将白菜滤出，滤液调节pH值为6.5，121 ℃下灭菌20 min。

1.2 仪器设备

SW-CJ-1F型单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司;BL-100G型全自动立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂;XSP-580A型生物显微镜：上海中恒仪器有限公司;756型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司;PHS-3C型精密酸度计：上海晓霄试验设备仪器有限公司;GDYQ-901SC2型食品亚硝酸盐快速测定仪：长春吉大小天鹅仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 低温乳酸菌的驯化 将5株乳酸菌菌种（L1，L2，L3，L4，L5）分别接入MRS液体培养基中，放置于冰箱中，依次在15，13，11，9 ℃下培养，使其逐步适应低温环境。然后以经过低温驯化的菌种作为种源进行后续试验。

1.3.2 供试菌株产酸能力的测定 将5株乳酸菌菌种（L1，L2，L3，L4，L5）分别接入MRS培养基中进行扩繁，然后将待测菌株的培养液以相同的接种量（1%）接入酸菜生产种培养基中，在10 ℃下培养，每隔2 h取样，测定培养液的pH值，观察产酸情况;用紫外分光分度计在波长600 nm下测定培养液的吸光度值（OD值），根据培养液的浑浊程度来判断菌株生长情况。每个处理重复3次，取平均值。

1.3.3 供试菌株降解亚硝酸盐能力的测定 将5株乳酸菌菌种（L1，L2，L3，L4，L5）依次接种到MRS培养基和酸菜生产种培养基中进行扩繁，然后将生产种接入白菜中压实密封，置于10 ℃的低温环境下发酵，每隔2 d监测其亚硝酸盐含量，判断其降解亚硝酸盐的能力。

1.3.4 供试菌株乳酸菌素产量的测定 乳酸菌素是由乳酸菌生长过程中产生的一种具有活性的多肽或蛋白质，有一定的抑菌作用。通过测量抑菌圈的大小来判断乳酸菌素的含量。采用琼脂扩散法，以金黄色葡萄球菌为指示菌，将受试致病菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板（厚度4 mm）上，然后在琼脂上打孔（孔径5 mm）并封底，将5株待测菌株的代谢产物加满孔中，培养24 h后测量抑菌圈直径，根据抑菌圈大小判断其抑菌效果，从而推断其产生乳酸菌素的含量。每个处理重复3次，取平均值。

1.3.5 供试菌株发酵酸菜的感官评价 将5株乳酸菌菌种（L1，L2，L3，L4，L5）按照1.3.3的方法进行扩繁，接入白菜发酵一个月后，对酸菜的风味、口感、色泽、质地进行评价。评分标准：风味，有发酵的酸香味为5分，酸味刺鼻为0分;口感，酸爽可口为5，酸味不正为0分;色泽，浅黄有光泽为5分，灰暗无光泽为0分;质地，脆嫩为5分，质地发软为0分。

2 结果与分析

2.1 供试菌株产酸能力

不同菌株发酵过程中发酵液pH值变化情况见表1。

由表1可知：L1发酵前期产酸较快，后期产酸尚可;L3和L5前期产酸较慢，但后期产酸较好;L2整个发酵过程中产酸情况都不理想;L4较L2稍好，但比L1，L3，L5较差。

2.2 供试菌株生长情况

不同菌株发酵过程中发酵液光密度值（OD值）变化情况见表2。

由表2可知：L1，L3发酵初期生长速率较快，发酵后期尚可;L5虽然前期生长较慢，但后期生长速度较快，甚至超越了L1。

2.3 供试菌株不同发酵时期亚硝酸盐含量

不同菌株发酵过程中亚硝酸盐含量测定情况见表3。

由表3可知：L3在发酵26 d时，亚硝酸盐含量最低;L1与L5稍微高一点，但区别不大;L2和L4较差，但均远低于国标规定的亚硝酸盐含量。

2.4 供試菌株代谢产物乳酸菌素含量的测定

不同菌株抑菌圈大小测定结果见表4。

由表4可知：L3抑制葡萄球菌效果较好;L1与L5抑菌效果尚可;L2和L4抑菌效果较差。

2.5 供试菌株发酵酸菜的感官评价

不同菌株发酵酸菜的品质评价情况见表5。

由表5可知：L1最好，L3和L5稍差，但明显优于L2和L4。

综合以上各组试验结果以及酸菜品质评分情况，从5株分离鉴定的乳酸菌种中筛选出各项性能指标良好、发酵酸菜品质优良的乳酸菌菌种为L1和L3。

3 结论

本试验筛选的耐低温乳酸菌菌种可以在酸菜发酵期间降低对环境温度的要求，从而为企业节省能源、降低成本;并且通过筛选得到各项性能优良的乳酸菌菌种，可以保证生产出的酸菜无论品质还是安全性都大大提高。对于目前采用自然发酵生产酸菜的企业而言，应用乳酸菌菌种发酵改进酸菜生产工艺，与以往添加防腐剂相比，并不会增加成本，同时可缩短生产周期，提高产品质量，使酸菜更加营养、安全、美味;对于目前利用乳酸菌接种生产酸菜的企业而言，应用耐低温乳酸菌菌种可以大大降低能耗，减少生产成本，增强市场竞争力。耐低温乳酸菌菌种的筛选，有利于直投式乳酸菌酸菜的推广，可以在很大程度上提高酸菜产品的安全性，对于有效促进酸菜行业健康有序发展具有深远意义。

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Screening of Lactic Acid Bacteria Resistant to Low Temperature

Pickled Cabbage by Natural Fermented in Northeast China

ZHANG Xiaoli， WU Xingzhuang， GAO Ya

（Institute of Food and Processing， Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161， China）

Abstract： In the condition of 10 ℃ low temperature， the isolated lactobacillus strains were used to carry out the application test. Inoculated cabbage was fermented. In the fermentation process， the acid production rate， acid production amount， nitrite degradation capacity and lactobacillus production were determined. Taking the flavor of finished pickled cabbage as the final evaluation index， 2 strains of low-temperature lactic acid bacteria with fast acid production speed， strong acid resistance， strong ability to degrade nitrite and high lactobacillus production were screened out.

Key words： pickled cabbage; lactic acid bacteria; bacteria screening; low temperature resistant