邻苯二甲酸酯类增塑剂的体外细胞毒性评价

段晨晖，房彦军，梁俊, 高志贤,#

1. 天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室, 天津 300457 2. 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所, 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室, 天津 300050

增塑剂可以提高塑料产品的透明性、可塑性和柔韧性，被广泛应用于塑料包装的生产过程中[1]。近年来，增塑剂特别是邻苯二甲酸酯类物质，引起了不少食品安全事件。邻苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)广泛应用于塑料快餐盒、生鲜食品保鲜膜及食品容器中，造成食品的污染[2]。另外，这类物质非常容易散发到空气中，难以降解，已成为全球性污染物。中国湖泊、江河中都普遍检出了PAEs，最常见的是邻苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)。DBP和DEHP是长江的主要污染物，浓度为35.65和54.73 μg·L-1，天津海河中也发现了最高浓度为41 μg·L-1的 DBP和101 μg·L-1的DEHP[3]。另外，在人体尿液和组织样本中也检测到了邻苯二甲酸酯代谢物成分。Gao等[4]对中国新生儿母亲群体进行了PAEs的累积暴露风险评估(CRA)，结果显示，至少1.9%的新生儿母亲的危险指数(HI)大于安全阈值，这说明PAEs在人群中存在潜在的不良影响。大量的研究表明，PAEs能够干扰人类和动物一些激素调节的生理过程，改变内分泌和生殖系统的正常功能，是一种典型的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[5]。另外，这类物质还具有一定程度的神经毒性、生殖发育毒性和潜在的致癌作用。最近的一些研究结果表明，低分子量的PAEs如DEHP和DBP毒性相对较强，而高分子量的PAEs如邻苯二甲酸二异壬酯(diisononyl phthalate, DINP)毒性相对较弱[6]。REACH是欧盟关于化学品及其安全使用的法规，一些低分子量的PAEs如DBP、邻苯二甲酸丁基苄酯(benzyl butyl phthalate, BBP)、DEHP和邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate, DIBP)在REACH中被归类为非常危险的物质。在动物研究的基础上，欧洲当局将它们归类为1B类，即被认为对生殖有毒的物质[7]。表1总结了几种常见的PAEs的暴露水平[8-13]。

针对人体尤其是婴幼儿长期暴露于这些物质造成的健康风险，有必要对其毒理效应进行全方位的评估。PAEs毒理学效应研究的传统方法主要是体内实验，即传统的整体动物毒性研究，虽然这种方法能够为毒理学研究提供全面而丰富的数据和资料，但其所需的费用大、时间长，所得的毒性结果往往是继发性的或最后的综合损伤。由于传统体内试验的诸多不便之处，更具针对性的体外细胞毒性评价开始越来越多地应用在PAEs毒理学效应的研究中。近年来，体外细胞毒性评价由于其周期短、成本低和作用机制易于探明等优势得到快速的发展[14]，成为PAEs毒理学研究的主流方法。与传统的动物模型毒性评价相比，体外细胞毒性评价具有高通量、低成本、灵敏度高和重复性好等优点，适合针对特定作用位点进行快速初筛，减少了实验动物的使用，提高了毒理学检测的效率。本文从内分泌干扰毒性、生殖发育毒性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性以及致癌作用几个方面对PAEs的体外细胞毒性评价方法进行介绍，并简略概述了其基本原理。

表1 几种常见的邻苯二甲酸酯(PAEs)代谢物在人体内的暴露水平Table 1 Exposure levels of several common phthalate esters (PAEs) metabolites in humans (ng·mL-1)

注：DEHP表示邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，mMP表示邻苯二甲酸单甲酯，mEP表示邻苯二甲酸单乙酯，mBP表示邻苯二甲酸单丁酯，miBP表示邻苯二甲酸单异丁酯，mECPP表示邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羧基戊基)酯，mCMHP表示邻苯二甲酸单[(2-羧甲基)己基]酯，mEHHP表示邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羟基己基)酯，mEOHP表示邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯，mEHP表示邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯，na表示数据不可得(尚未得到相关数据)。
Note: DEHP stands for bis(2-ethylhexyl) phthalate; mMP stands for monomethyl phthalate; mEP stands for monoethyl phthalate; mBP stands for monobutyl phthalate; miBP stands for mono-2-isobutyl phthalate; mECPP stands for mono(2-ethyl-5-carboxypentyl) phthalate; mCMHP stands for mono-[(2-carboxymethyl)hexyl] phthalate; mEHHP stands for mono(2-ethyl-5-hydroxyhexyl) phthalate; mEOHP stands for mono-(2-ethyl-5-oxohexyl) phthalate; mEHP stands for mono(2-ethylhexyl) phthalate; na stands for not available (data has not been obtained yet).

1 PAEs内分泌干扰毒性的体外检测(In vitro evaluation of endocrine disrupting effects of PAEs)

目前，常用的PAEs内分泌干扰效应体外检测方法主要有2类：一类是核受体介导的报告基因方法，主要用来检测目标化合物对与内分泌功能相关的一些核受体的干扰作用；另一类是检测目标化合物对一些特定细胞激素合成、分泌、转运和代谢的影响。这2类测试方法的作用原理和途径各不相同，具有其各自的优势和应用范围。

1.1 核受体介导的报告基因方法

类固醇激素(包括雌激素、雄激素和孕激素等)，可直接进入细胞内与相应受体结合成复合物，并转移至细胞核内激活靶基因的转录，完成一系列复杂的生物学功能。这些受体是一类极其重要的转录调节因子，称为核受体超家族(nucleic receptor superfamily)[15]。雌激素受体(estrogen receptor, ER)、雄激素受体(androgen receptor, AR)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor, TR)和维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR) 都是重要的转录调节因子，可与激素或配体结合后转移到细胞核内，激活靶基因转录并发挥调节作用，与生殖过程、新陈代谢调节和分化发育密切相关。

Engel等[16]运用稳定转染的细胞系ERα-HEK和ERβ-HEK进行了荧光素酶报告基因测定(luciferase reporter gene assay)，检测了一些PAEs及其主要和次要代谢物对人类ERα或ERβ活性的影响。实验结果表明，除了BBP以外的其他PAEs及其代谢产物均未增强ERα和ERβ的活性；而大部分PAEs对ERα和ERβ的活性具有抑制作用。Ghisari和Bonefeld-Jorgensen[17]使用MVLN反式激活报告基因法测定了几种PAEs对ER的诱导作用，在该测定中，只有BBP和DBP微弱增强了ER的活性，DEHP、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)未引起ER介导的反应。沈欧玺[18]运用核受体介导的报告基因试验方法(也称为转录激活试验)，研究了2种邻苯二甲酸酯类增塑剂及其代谢物包括DEHP、DBP和邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate, MBP)对ER、AR和TR的干扰作用。研究结果表明，这3种物质均具有抗雄激素活性和抗甲状腺激素活性，无拟雌激素活性。Czernych等[19]使用双酵母杂交技术(XenoScreen YES/YAS)研究了几种PAEs的雌激素和雄激素活性，发现一些PAEs在较低的浓度范围内表现出较强的抗雌激素和抗雄激素效应。

这类核受体介导的报告基因检测方法普遍具有高通量、低成本和灵敏度高等优势，但其局限性在于只能用来评价环境内分泌干扰物对核受体的干扰作用。内分泌系统是一个复杂精密的系统，环境污染物不仅可以通过影响天然激素与受体结合的受体介导途径发生作用，还可通过干扰激素合成、分泌、转运和代谢等非受体介导途径干扰内分泌系统的正常运作[20]。

1.2 非受体介导途径的体外细胞模型

为了检测一些环境污染物非受体介导途径的内分泌系统干扰作用，各种具备不同功能和特点的细胞模型也陆续被开发出来。

激素应答小鼠睾丸间质肿瘤细胞系(Hormone-responsive mouse Leydig MA-10 tumor cell line)是一种有效的激素应答细胞模型，这种细胞能够在人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)的作用下诱导孕酮的生成。Boisvert等[21]测试了DEHP的代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(mono(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP)对MA-10细胞中孕酮合成的影响，结果显示，浓度为10-4mol·L-1的MEHP显著抑制了MA-10细胞孕酮的生成。H295R细胞系源于人肾上腺皮质瘤，能表达类固醇激素合成过程中涉及的所有酶类，具有类似未分化的胚胎肾上腺细胞的生理特性，能生成肾上腺皮质合成的所有类固醇激素，如孕激素、雄激素、雌激素、糖皮质激素和盐皮质激素等，并与正常的人肾上腺细胞对毒物的反应水平一致[22]，因此，H295R 细胞系成为体外筛选环境类固醇激素干扰物和研究其机制的最具潜力的工具。Harvey 等[23]指出 H295R 细胞系是一种有效的体外筛选环境类固醇激素干扰物的细胞模型。叶婷等[24]研究了DEHP及其代谢产物MEHP对H295R 细胞类固醇激素合成有关的关键基因表达的影响，实验结果表明，DEHP、MEHP均可影响H295R细胞类固醇激素合成过程中关键基因的表达，并且MEHP 的影响更加明显。Mankidy等[25]通过H295R类固醇生成实验，发现暴露于10 mg·L-1的DEHP导致培养基内的雌二醇(E2)浓度增加4倍；暴露于10 mg·L-1的DEP导致培养基内的E2浓度增加2.3倍。除此之外，人胎盘绒毛膜癌(JEG-3)细胞系也是一种很有效的细胞模型，这种细胞能够表达在发现于胎盘中的特定类固醇生成酶中，并具有非常高的芳香酶活性[26]。由CYP19编码的胎盘芳香酶催化雄激素芳构化为雌激素，它是雌激素生物合成中的关键酶，也是内分泌干扰物靶向的关键终点[27]，这对于母体怀孕期间的健康非常重要。Perez-Albaladejo等[28]研究了一些PAEs对JEG-3细胞系P450芳香酶活性的影响，实验结果表明, BBP和DBP显著降低了P450芳香酶的活性(IC50值大致为14 ～15 μmol·L-1)。综上所述，一些PAEs在人和动物体内所造成的内分泌干扰效应很有可能是通过干扰激素合成的途径引起的。

2 PAEs胚胎发育毒性的体外检测(In vitro detection of embryonic developmental toxicity of PAEs)

大量动物研究表明，DEHP具有胚胎毒性，影响胚胎、胎儿发育。近20年来，随着干细胞研究的日臻成熟，胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)已成为发育毒性实验的一种崭新受试对象，能灵敏、准确地评价有害物质的毒性作用[29]。根据胚胎干细胞特性发展起来的胚胎干细胞模型，可用于评价环境内分泌干扰物潜在的胚胎毒性和致畸性。

崔栋等[30]建立了小鼠胚胎干细胞试验模型，对DEHP的胚胎毒性进行了评价，研究结果表明，DEHP为弱胚胎毒性化合物。Yin等[31]使用小鼠胚胎干细胞评估了DEP和DBP的早期发育神经毒性。实验结果表明，在浓度约为10 μmol·L-1时，DEP和DBP可以显著改变神经外胚层与神经祖细胞形成过程中关键基因的表达，这表明DEP与DBP具有潜在的神经发育毒性。李玉秋等[32]分析了不同浓度的DEHP及其代谢产物MEHP对小鼠胚胎干细胞活力与增殖的影响，研究发现随着染毒剂量的增加(0.01～1 000 μmol·L-1)，DEHP、MEHP 对小鼠 ESC 活性的抑制作用增强，且存在明显的剂量-效应关系，高剂量(1 000 μmol·L-1)的DEHP和MEHP对小鼠胚胎干细胞的增殖具有明显的抑制作用。

综上所述，经过许多研究者的验证，ESC已越来越多地应用于化学品胚胎发育毒性的预测。胚胎干细胞试验(embryonic stem cell test, EST)使用小鼠或人的胚胎干细胞来评估化学物潜在的胚胎发育毒性，非常适合于胚胎毒性评估。目前EST已经被证明能够在早期胚胎发育以及基因表达模式分化的时期指定细胞发育的流程[33]，从而得到不同功能的细胞类型，这种强大的分化潜力为化学物的毒理研究提供了丰富的实验素材。

3 PAEs神经毒性的体外检测(In vitro detection of neurotoxicity of PAEs)

近几年，PAEs的神经毒性开始受到人们的关注。PAEs具有脂溶性，易通过胎盘及血脑屏障进入脑组织，影响神经系统的发育[34]。流行病学调查研究显示，尿液中的DEHP代谢物MEHP的浓度可能与儿童的注意缺陷多动症有关[35]。此外，有人发现胚胎期暴露于DEHP可损伤啮齿动物的记忆行为，并认为可能与神经细胞内Ca2+浓度升高以及诱导神经细胞凋亡有关[36]。目前，对于PAEs神经毒性的体外评价主要是从待测细胞的氧化应激、细胞凋亡以及增殖分化这几个方面进行。

PC 12 细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，因其在神经生长因子刺激培养下表现出的形态、结构和功能皆类似于神经细胞，因而在神经科学实验研究中得到广泛应用[37]。朱才众等[38]研究了低剂量的DBP对PC12细胞的毒性效应，结果表明，不同剂量的DBP暴露对PC12细胞的增殖具有显著的抑制作用，且在低剂量慢性暴露条件下引起了PC12细胞的凋亡。同时DBP暴露还显著降低了PC12细胞的脂质过氧化物酶活性，造成了细胞的氧化应激损伤。Chen等[39]使用PC12细胞作为神经发育模型来研究MEHP暴露对神经元发育过程的影响，他们将未分化的PC12细胞暴露于MEHP中，研究其对细胞增殖和分化的影响。实验结果表明，MEHP以剂量依赖性的方式抑制细胞增殖，并且促进了PC12细胞的胆碱能表型分化。这是MEHP通过影响细胞增殖和分化中的特定事件引发神经发育毒性的第一次证明。除了PC12细胞，小鼠神经瘤细胞也可作为研究神经毒性的模型细胞。闵安娜等[40]研究了BBP对小鼠神经瘤细胞的凋亡和氧化损伤水平的影响，研究发现，当BBP染毒浓度≥5 g·L-1时，存活细胞减少，并且细胞界限不清，开始出现凋亡小体，这说明高浓度的 BBP 可以抑制神经细胞的生长并造成神经细胞的凋亡；而对染毒后细胞的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)以及还原型谷胱甘肽(GSH)含量的测定结果则表明BBP的暴露可以引起神经瘤细胞的氧化损伤，从而进一步诱导了细胞的凋亡。

4 PAEs免疫毒性的体外检测(In vitro detection of immunotoxicity of PAEs)

免疫毒性是指外源化学物通过损伤一些免疫细胞的形态和功能，干扰神经内分泌网络，使得机体免疫功能低下；或是通过影响免疫细胞的抗原识别能力和敏感性，导致过度的免疫应答，从而引起超敏反应或自身免疫性疾病。有关PAEs的免疫毒性，特别是其对免疫细胞的作用和介导超敏反应的研究已经有了一些进展。Hoppin等[41]在美国全国范围内调查了人群尿液中的PAEs代谢产物含量并调查了人群过敏症状，对相关数据进行了分析统计，结果显示，DEHP和BBP的代谢产物能够诱导与哮喘、花粉热和关节炎等疾病密切相关的19种特异性抗体的产生，这说明，PAEs的接触暴露与一些超敏反应及自身免疫性疾病的发病有关。Kruger等[42]研究发现，人角膜内皮细胞B4G12暴露于DEHP后，炎症相关因子IL-1β、IL-8和IL-16的分泌增加，其基因表达水平也有所升高。韩佳萦等[43]研究了DEHP对巨噬细胞的免疫毒性作用，实验中采用了不同剂量的DEHP处理小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，通过检测细胞活力、细胞吞噬能力、细胞因子分泌及活性氧水平的变化来评估DEHP暴露对免疫系统的毒性作用；实验结果表明，高浓度的DEHP处理可造成RAW264.7细胞的急性损伤，抑制了其细胞吞噬能力和细胞因子(TNF-α、IL-12和IL-23)的分泌能力，并且造成细胞内的活性氧产生。以上研究均表明，PAEs的暴露可从多方面影响免疫应答，造成免疫毒性作用。

5 PAEs遗传毒性的体外检测(In vitro detection of genotoxicity of PAEs)

目前，已经有许多体内外的研究表明，PAEs暴露能够造成染色体和DNA的损伤，引发遗传毒性作用。单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis, SCGE)又称彗星实验，是一种广泛应用于遗传毒理学的技术，在检测一些外源化学物对DNA的损伤方面有很高的灵敏性。Wang等[44]使用人胚胎肾细胞系(HEK-293)，通过单细胞凝胶电泳检测了DEHP诱导的DNA链断裂，并通过检测细胞中GSH含量的变化评估了氧化应激在DNA损伤过程中的作用；实验结果表明，DEHP能够引起HEK-293细胞的DNA损伤，DEHP是通过氧化应激诱导DNA链断裂的，研究还发现，溶酶体和线粒体可能是DEHP诱导DNA损伤的重要靶点。细胞分裂阻滞微核测定(cytokinesis-block micronucleus, CBMN)也是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种试验方法。Molino等[45]运用了彗星试验和微核测定2种方法评估了不同浓度的DEHP对欧洲鲈鱼胚胎细胞系(DLEC)的遗传毒性作用；彗星试验的结果表明，DLEC细胞DNA链断裂的总量随着DEHP浓度的增加而显著增加；微核测定的结果表明，DEHP染毒浓度的增加引起了DLEC细胞微核率的显著上升。以上研究都充分证明了PAEs潜在的遗传毒性作用。

6 PAEs致癌作用的体外检测(In vitro detection of carcinogenesis of PAEs)

PAEs潜在的致癌作用也是近年来学者关注的重点。流行病学研究表明，PAEs暴露与人乳腺癌发病率呈正相关[46]。Crobeddu等[47]将乳腺癌上皮细胞T-47D暴露于接近环境剂量的DEHP和MEHP，实验结果表明暴露于10 000 nmol·L-1的DEHP或0.1 nmol·L-1的MEHP可显著促进T-47D细胞的增殖，而不会诱导细胞凋亡。该实验还表明，DEHP和MEHP可以通过激活孕酮受体(progesterone receptor, PR)信号传导促进乳腺癌上皮细胞的增殖，这可能增加乳腺癌发生的风险。Wu等[48]研究了BBP对ER(+)MCF-7乳腺癌细胞与ER(-)MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的诱导作用，实验结果表明，BBP能够显著促进这2种乳腺癌细胞的增殖，并加速其细胞周期从G1期进展至S期。同时，该研究团队还首次发现microRNA-19通过靶向PTEN 3’UTR(某种抑癌基因片段)，在BBP促进乳腺癌细胞增殖的过程中发挥了至关重要的作用。Zhu等[49]研究发现，低剂量的PAEs (DEHP、DBP和BBP)能够促进PC-3和22RV1前列腺癌细胞的增殖，改变细胞周期相关基因的表达，并激活与癌症细胞增殖密切相关的一些转录因子，这说明PAEs可能是前列腺癌的癌症启动子。

7 总结及展望(Summary and prospects)

随着国内外学者对PAEs毒理作用研究的不断深入，各种针对其内分泌干扰效应、生殖发育毒性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性以及致癌作用的体外细胞毒性评价模型开始得到广泛的应用(表2)。细胞毒性评价是从细胞类型的选择、到评价指标的确定、进而选择适合的检测方法的过程。在这一过程中，需要根据所测试的毒性效应来选择具有不同功能和特点的细胞模型，例如，在评价待测物的内分泌干扰效应时被广泛应用的核受体介导的报告基因筛选细胞模型，用于胚胎发育毒性评价的ESC试验模型，用于评价神经毒性作用的PC12细胞和神经瘤细胞模型，以及用于免疫毒性检测的巨噬细胞模型等。体外细胞毒性评价具有周期短、成本低和机制易于探明等优点，细胞培养所需器材和原料的成本与动物养殖相比较低廉，且不像动物实验那样需要大量的人力投入，相对地易于操作和管理，节省人力物力。目前，PAEs体外细胞毒性评价的研究领域已经从细胞水平上升到基因水平，通过数字基因表达谱测序、荧光定量PCR(qRT-PCR)等分子生物学技术，能够筛选出一些与细胞凋亡、增殖、代谢和分化等生理指标密切相关的差异表达的基因，进而揭示出PAEs不同毒性效应的作用机制。

PAEs在环境中的浓度很低，大多数在机体中通过不断蓄积或者几种化学物共同作用，对生殖、免疫和神经系统造成损害，严重影响机体健康[50]。而且PAEs是脂溶性物质，这些物质在环境中被动物和人体接触暴露后，一旦进入体内，便很快积蓄到脂肪组织里，不宜排泄出去，这可能导致动物体内高浓度的PAEs残留。由此可见，除了单一的体外细胞毒性研究，PAEs对人和动物整体毒性作用的研究也是非常必要的。体外细胞试验模型在毒理学评价的过程中虽然具有各种显著的优势，但也有其不足之处。由于细胞毒性评价只是体外单细胞水平上做出的毒性评估，没有生物整体水平上的验证，缺乏生物体内各细胞、组织和系统之间的相互联系，因此无法准确地得出PAEs在体内环境下经各系统作用后的整体毒性。因此，PAEs的体外毒性评价还需与体内实验相结合，或是尽可能地模拟体内环境，增强实验数据的准确性与可靠性。相信随着新的技术和方法的不断出现，以及国内外学者的共同努力，PAEs毒理学效应的研究将会迈向更高的水平。

表2 用于邻苯二甲酸酯(PAEs)体外细胞毒性评价的细胞模型汇总Table 2 Summary of cell models for in vitro cytotoxicity evaluation of phthalate esters (PAEs)