培养基对大型溞(Daphnia magna)生长、繁殖和子代的影响

许玉洁，高亮，陈进林，余明喧，冯宝欣，黄叶梅，梅承芳，曾国驱,*

1. 广东省科学院广东省微生物研究所，广州 510070 2. 华南应用微生物国家重点实验室，广州 510070 3. 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070 4. 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070

大型溞(Daphniamagna)属节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)，在世界范围内的淡水水域广泛分布[1]，是水生生态系统能量转化和物质循环的关键环节[2-3]。由于敏感性高，繁殖周期短，能够通过孤雌生殖获得基因型一致的克隆体[4-6]，大型溞作为化学毒理学评估的推荐物种，广泛用于水生生物毒性试验和评价[7]。

实验室中大型溞的培养可采用天然水体或人工、半人工的培养基。天然水体包括井水、自来水，人工培养基包括Elendt M4培养基、Elendt M7培养基和ISO培养基等化学品测试导则推荐的培养基。研究表明，大型溞培养过程中的水质和营养会显著影响试验动物的健康状态，从而影响毒理试验的可靠性[8-9]。人工培养基固定的化学组成能够为大型溞培养提供稳定的环境，减少由于地域环境影响产生的差异，有利于提高生态毒理学评价的可还原性和标准化程度，减少实验室之间测试结果的差异性。

Elendt M4培养基是经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)在化学品测试指南—大型溞急性活动抑制试验导则(OECD 202-2011)中推荐使用的试验培养基[10]，也是目前实验室中较常见的用于大型溞连续培养和试验的培养基。由于Elendt M4培养基中含有螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，在测试样品中含有重金属离子时，培养基中的EDTA会与金属元素形成络合物。Sorvari和Sillanpää[11]的研究表明，在添加EDTA的情况下，Mn2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+对大型溞的毒性均下降，Fe3+的毒性没有变化，Hg2+的毒性反而升高。Guilhermino等[12]使用Elendt M7、ASTM和EEC这3种培养基进行金属离子对大型溞的急性活动抑制试验，结果表明，在含有EDTA的Elendt M7培养基中，Cd2+和Cu2+的毒性都比在不含螯合物的ASTM或EEC培养基中低一个数量级。因此，在对含重金属离子或成分不明的样品进行测试时，推荐去除培养基中EDTA的成分或使用不含EDTA的培养基配方[13-14]。

本研究选择了美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials, ASTM)推荐的ASTM培养基和国际标准化组织(International Organization for Standardization, ISO)推荐的ISO培养基与Elendt M4培养基进行比较。这2种培养基均不含螯合剂，可在进行含重金属离子的毒性试验中作为Elendt M4培养基的替代品。试验通过比较3种培养基对大型溞生长、繁殖和对重铬酸钾毒性敏感性的影响，筛选出适合实验室大型溞培养和毒理学试验的培养基，为毒理学试验中培养基的选择提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验培养基

选用Elendt M4、ASTM和ISO这3种培养基。3种培养基的配制方法见文献[10,13-14]，主要成分的比较如表1所示。

1.2 试验生物

大型溞引种于沈阳化工研究院安全评价中心，并在本实验室参照大型溞测试标准方法进行饲养。试验开始前亲溞分别在3种试验培养基中培养至少21 d并保持孤雌生殖状态，选择出生6～24 h，活泼、健康和大小尽量一致的幼溞进行试验。

1.3 试验饵料

羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，在本实验室培养。在经过灭菌的OECD培养基中接入羊角月芽藻，在(22±2) ℃、4 400～8 800 lx条件下培养，收集处于对数生长期的藻液，经过8 000 r·min-1离心5 min，收集藻细胞，再用去离子水悬浮。测定羊角月芽藻浓缩液的吸光值和总有机碳(total organic carbon, TOC)浓度，获得TOC浓度(x)-吸光值(y)的线性方程为y=0.0393x+0.0072，R2= 0.9969。

1.4 大型溞繁殖试验方法

21 d繁殖试验参照OECD化学品测试准则的标准方法进行[15]，设置3个培养基试验组，每组10个平行，试验容器为100 mL烧杯，盛放80 mL试验培养基及1只幼溞。试验条件为水温(20±2) ℃，光暗比16 h∶8 h，光照强度1 000～1 500 lx。试验期间采用半静态试验系统，每48 h或72 h更新培养基。每天投喂羊角月芽藻，喂食量为0.1～0.2 mg C·d-1。

试验期间每24 h观察一次亲溞的外观和存活情况，及时移除生产的幼溞并计算存活幼溞的数量，记录亲溞的死亡率、所产幼溞的数量、初次怀卵时间、初次生殖时间和总生殖胎数。试验结束后采用游标卡尺测量亲溞的体长(从头盔至壳刺部的长度)。

1.5 重铬酸钾对大型溞急性活动抑制试验方法

分别收集繁殖试验中各试验组出生的非头胎幼溞进行试验(溞龄为6～24 h)。设置重铬酸钾浓度为0.60、0.82、1.11、1.51、2.05和2.79 mg·L-1。采用去离子水配制浓度为100 mg·L-1的重铬酸钾母液，分别用Elendt M4培养基、ASTM培养基和ISO培养基将母液稀释至设置浓度后开始试验。每个浓度4个平行，试验容器为100 mL烧杯，盛放50 mL试验溶液，每个烧杯中放置5只的幼溞。试验条件为水温(20±1) ℃，光暗比16 h∶8 h，光照强度1 000～1 500 lx。于试验开始后24 h观察和记录溞类的活动与生存情况，发现死溞及时取出。溞类活动抑制辨认时，轻晃试验容器，15 s内不能游动则认为活动抑制。

表1 3种培养基主要成分的比较Table 1 Comparative summary of major constituents of three test media

1.6 数据处理

对大型溞繁殖试验的数据进行正态分布检验(采用Shapiro-Wilk test检验)、方差齐性检验(采用Levene’s test检验)。在数据符合正态分布且等方差条件下，使用方差分析(ANOVA)检验其显著性差异，并利用多重比较(LSD test，最小显著差异法)分析处理之间的差异显著性。若数据不符合正态分布或存在不等方差性时，采用非参数检验(Kruskal-Wallis test)分析其显著性差异。所有数据统计分析均在SPSS 20.0软件中进行。24 h-EC50值是根据急性活动抑制试验数据采用SPSS20.0软件中的Probit Analyze功能分析得到，并通过线性回归计算得到剂量-效应方程。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 大型溞繁殖试验

2.1.1 3种培养基对大型溞存活和生长的影响

由表2可知，3种培养基中亲溞21 d的死亡率均为0%且亲溞的体长无显著差异(P>0.05)。试验过程中，3个试验组的亲溞均未观察到行为异常或体色改变的现象，说明3种培养基对亲溞的存活和生长均无负面影响。在水生生物的毒性试验中，培养基选择的最低要求是试验生物在试验期间能够在其中健康存活，并且不会出现任何受到抑制的表现(如变色、行为异常或死亡)，而更好的培养基则是能够使水生生物在其中良好的生长和繁殖[14]。3种培养基均能满足毒性试验对试验培养基的基本要求。

2.1.2 3种培养基对大型溞繁殖的影响

Elendt M4培养基中亲溞的初次怀卵时间为6～9 d，ISO培养基中亲溞的初次怀卵时间为6～8 d，ASTM培养基中亲溞初次怀卵时间均为8 d。ASTM培养基中大型溞初次怀卵的时间在统计学中显著长于Elendt M4培养基和ISO培养基(P<0.05)，但其初次怀卵时间均处于另2种培养基初次怀卵的时间范围之内。大型溞的初次繁殖时间的平均值为ISO > ASTM > Elendt M4，其中ISO培养基中大型溞的初次繁殖时间显著晚于ASTM和Elendt M4培养基(P<0.05)，说明ISO培养基虽然不影响大型溞的怀卵，却会影响幼溞的出生，造成产溞延迟。ASTM培养基中亲溞初次怀卵时间和初次繁殖时间的标准差均小于另外2种培养基，说明该培养基中亲溞繁殖的同步性好于其他2种培养基。结果如图1所示。

图1 亲溞初次怀卵时间和初次繁殖时间注：*表示与空白对照组(Elendt M4培养基)差异显著(P<0.05)。Fig. 1 Time to the presence of the fist eggs and production of first brood of Daphnia magnaNote: * indicates significant differences with blank control (Elendt M4 medium) (P<0.05).

由图2可知，亲溞的初次产溞数从大到小依次为Elendt M4 > ASTM > ISO。其中，ISO培养基的初次产溞数显著低于Elendt M4培养基和ISO培养基(P<0.05)。ISO培养基中亲溞的繁殖胎数和每胎产溞数均显著低于另外2种培养基(P<0.05)。这说明，ISO培养基不仅会推迟亲溞的繁殖时间，导致繁殖胎数减少，也会降低每次亲溞的产溞数，从而降低了大型溞的总产溞数。由表2可知，3种培养基中亲溞的总产溞数由大到小依次为Elendt M4 > ASTM > ISO，其余2种培养基与Elendt M4培养基均差异显著(P<0.05)。3种培养基中亲溞的总产溞数均大于60只/亲溞，满足OECD对大型溞繁殖试验的质量控制标准[15]。在试验过程中，ISO培养基中观察到死胎的现象，说明ISO培养基对大型溞的繁殖具有很明显的伤害作用。

表2 大型溞繁殖试验中生长、繁殖指标Table 2 Growth and reproduction parameters in Daphnia magna reproduction test

注：*表示与空白对照组(Elendt M4培养基)差异显著(P<0.05)。
Note: * indicates significant differences with blank control (Elendt M4 medium) (P<0.05).

图2 亲溞初次产溞数、每胎产溞数和繁殖胎数注：*表示与空白对照组(Elendt M4培养基)差异显著(P<0.05)。Fig. 2 Number of living offspring in first brood and per brood, and the total number of broodsNote: * indicates significant differences with blank control (Elendt M4 medium) (P<0.05).

Elendt M4培养基中大型溞的繁殖胎数、每胎繁殖量和总繁殖量均高于另2种培养基，说明Elendt M4培养基在3种培养基中最适合大型溞的长期培养和繁殖。Klüttgen等[16]指出，由于人工培养基无法完全模拟大型溞的天然生存环境，因此，无法排除在长期培养中会对大型溞的生长和繁殖产生负面影响。为了克服这个问题，许多研究者采取添加有机提取物[8,14]或天然水体[17]的方法，而这又会产生因试验培养基不完全一致而影响试验标准化的问题。Elendt M4培养基作为一种标准化培养基，含有螯合剂、维生素和丰富的微量元素，能够较大程度地提供大型溞生长繁殖所需的营养，因此，能够取得较好的培养、繁殖效果。ISO培养基的主要成分与Elendt M4相同，但由于配方单一，大型溞的繁殖胎数和繁殖量均显著低于Elendt M4培养基，且在试验过程中出现死胎，说明ISO培养基并不适合大型溞的长期培养。ASTM培养基中大型溞怀卵较晚，繁殖胎数和每胎繁殖数等繁殖指标略低于Elendt M4培养基，但与其没有显著差异(P>0.05)，繁殖总数低于Elendt M4但高于ISO培养基(P<0.05)且能够满足质量控制要求。这说明，相比于ISO培养基，ASTM培养基是Elendt M4培养基在大型溞的长期培养或繁殖试验中更好的替代品。ASTM培养基中虽然不含有螯合剂，但添加了维生素B12和Se元素，一定程度上补充了大型溞生存所需的营养元素，这可能是ASTM培养基中大型溞繁殖量较高的原因。

2.2 急性活动抑制试验

由表3可知，重铬酸钾对大型溞的急性试验结果表明，Elendt M4培养基中大型溞的24 h-EC50为1.29 mg·L-1，95%置信限为1.16～1.43 mg·L-1；ASTM培养基中大型溞的24 h-EC50为1.84 mg·L-1，95%置信限为1.66～2.05 mg·L-1；ISO培养基中大型溞的24 h-EC50为0.772 mg·L-1，95%置信限为0.637～0.889 mg·L-1。3种培养基中大型溞对重铬酸钾的24 h-EC50值均在0.6～2.1 mg·L-1范围内，满足OECD对大型溞急性活动抑制试验的质量控制标准[10]，因此，都可用于大型溞的急性活动抑制试验。3种培养基的大型溞对重铬酸钾的敏感性大小为：ISO > Elendt M4 > ASTM。3组培养基的空白对照组中大型溞的活动抑制率均为0%，试验过程中3种培养基的空白对照组中大型溞均未出现体色改变、困于液面等异常现象，说明3种培养基在大型溞的短期试验中对其没有抑制作用。

表3 重铬酸钾对大型溞的EC50值和浓度-效应曲线Table 3 The EC50 value and concentration-response curve of potassium dichromate on Daphnia magna

本研究结果表明，不同培养基中大型溞产生的子代对重铬酸钾的敏感性有着明显的差别。因此，在设计试验时需要考虑到不同培养基中大型溞敏感性的不同，对不同研究进行横向比较时也应考虑到采用不同培养基对试验结果的影响。

2.3 毒理试验中对培养基的选择

目前在进行金属离子对大型溞的毒性效应试验时，研究者主要采用曝气除氯自来水作为试验培养基[18-19]。自来水成分的不确定性以及受地域差异的影响，不利于试验的标准化和不同实验室之间研究结果的比较。一些大型溞急性活动抑制试验也会采用ISO培养基作为试验培养基[20]。OECD导则中规定：在进行大型溞的急性活动抑制试验之前，大型溞需要在与试验相同的体系下驯养至少48 h，使其适应试验体系；进行大型溞的繁殖试验时，则至少需要驯养3周(一代)[15]。在急性活动抑制试验中，ASTM和ISO这2种培养基对大型溞的活动和生长均无抑制作用。因此，在进行短期驯养和急性活动抑制试验时，ASTM培养基和ISO培养基均可使用。在进行长期驯养或繁殖试验时，考虑到ISO培养基对亲溞繁殖的负面影响，推荐使用ASTM培养基。

综上所述，本研究考察了3种培养基对大型溞生长、繁殖的影响及其子代对参比物重铬酸钾的敏感性。结果表明，进行含有金属离子样品的毒理测试时，ASTM培养基和ISO培养基均可用于大型溞的短期驯养和急性活动抑制试验，ASTM培养基还可以用于长期驯养和繁殖试验。ASTM培养基和ISO培养基中大型溞的繁殖性能和亲溞所产的幼溞敏感性试验的结果均能满足标准要求，但在对试验结果进行解释和比较时仍需要考虑不同培养基中大型溞敏感性不同所导致的差别。