草甘膦铵盐暴露对乌龟胚胎发育、孵出幼体运动及学习表现的影响

胡英超，王杰，叶梦婷，党伟，陆洪良

杭州师范大学生命与环境科学学院，生态系统保护与恢复杭州市重点实验室，杭州 310036

草甘膦是全球范围内普遍使用的一种非选择性有机磷除草剂[1]。草甘膦制剂具有良好的水溶性，在田间被大规模施用。施用的草甘膦制剂大部分被快速降解，但残余物以及降解代谢产物仍会渗透到土壤中，或通过地表径流、田间排水系统等各种途径进入水环境，对栖息于水环境中的生物以及居住于污染区域周边环境中的其他动物及人体造成潜在危害。之前一些研究认为，草甘膦制剂对生态环境和生活于其中的生物毒害不大[2]。然而，近年来研究显示，草甘膦制剂对生物和人体的危害不可忽视[3-4]。当水体环境中草甘膦超一定浓度时，就可能对包括鱼类、两栖类在内的水生动物具有潜在毒性，造成幼体生长延迟、性腺发育畸形以及激素信号传递受阻等情况[5-8]。草甘膦对水生动物毒性效应的研究主要集中于鱼类[9-13]。虽然这些研究显示的结果并不一致，但已表明草甘膦暴露对鱼类的毒害作用是广泛的[2]。从导致不同程度的DNA损伤的遗传毒性到改变生理、形态、行为学特征或直接致死的毒性效应均有报道[5,9-13]。草甘膦的毒害作用可能不仅仅只发生在鱼类和较低等水生无脊椎动物中，对其他高等水生和陆生脊椎动物亦可能产生影响。例如一些证据显示，慢性低剂量草甘膦暴露与人类肥胖、不孕不育和癌症等临床疾病存在潜在关联[14]。

动物的运动能力和行为表现被认为是与其适合度密切相关[15]。检测受环境污染物胁迫作用下动物的运动行为反应是行为毒理学的主要内容，在一些鱼类毒理研究中已得到了广泛应用。阿特拉津、百草枯等农药及其他污染物暴露会显著影响斑马鱼(Barchydaniorerio)、日本青鳉(Oryziaslatipes)的运动行为表现[12,16-20]。例如，斑马鱼在氯化镉、敌敌畏污染胁迫下行为反应过度活跃，而行为强度和活动深度下降[19]。爬行动物是许多水域及陆地生态系统的重要组成部分，然而涉及此类动物(尤其是水生或半水生的龟鳖类)毒理学方面的研究报道很少[21-28]。例如，胚胎期多环芳烃、草甘膦制剂暴露分别影响北美拟鳄龟(Chelydraserpentina)和红耳滑龟(Trachemysscriptaelegans)的卵孵化成功率和孵出幼体表型[25-26]；水体中氯丹、二氯二苯三氯乙烷和多氯联苯等农药残留可能潜在地改变红耳滑龟、绿海龟(Cheloniamydas)等龟类的种群性比[22-23,29]。到目前为止，极少见有关于研究环境污染物暴露是否影响龟鳖类动物运动行为表现的报道[30]。本研究用不同浓度的草甘膦铵盐处理孵化过程中的乌龟(Mauremysreevesii)卵，通过测定孵出幼体的个体大小、游泳能力和迷宫学习表现来评价草甘膦暴露对龟鳖类动物的潜在毒性效应。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验龟卵采集和草甘膦溶液配制

实验用152枚乌龟卵于2014年7月中旬采购自海宁市龙头阁两栖爬行动物研究所。所有龟卵均当天收集，选取受精的龟卵后，放入装有湿润蛭石的泡沫盒内运回杭州实验室内。在实验室内，用Mettler-Toledo电子天平(型号：PB303-N，Mettler-Toledo仪器(上海)有限公司)称重，用点光源确定龟卵胚胎位置，用HB中华牌铅笔在胚胎位置的卵壳表面画上记号，并在旁边编上序号。

实验用草甘膦铵盐(C3H11N2O5P)样品采购自浙江新安化工集团股份有限公司，草甘膦含量为68%。称取适量固体草甘膦铵盐加入一定量蒸馏水配制成2 000 mg·L-1的母液，然后在2 000 mg·L-1母液中加入蒸馏水分别稀释10、100和1 000倍，以配制成200、20和2 mg·L-1的草甘膦铵盐溶液。

1.2 卵孵化及处理

实验设置一个对照组(蒸馏水0 mg·L-1)和4个不同草甘膦浓度(2、20、200和2 000 mg·L-1)的处理组。将卵随机地分配于不同处理组。所有龟卵孵化于水势约为-220 kPa的湿润基质中(蛭石与水的质量比为1∶1)。等量的湿润蛭石放在不同孵化盒中并铺平，将龟卵近胚胎的一面朝上半埋于湿润蛭石，孵化盒上覆有塑料薄膜以防止基质水分快速蒸发。所有含龟卵的孵化盒均放置于温度为29 ℃(该温度为乌龟胚胎发育的最适温度，使卵孵出1∶1雌雄性比的幼体[31])的人工气候室内。孵化过程中，每隔2 d对孵化盒称重并及时补充基质水分以保持其湿度恒定。

每日上午8:00—10:00期间，用移液枪吸取100 μL相应浓度的暴露溶液均匀地涂抹在胚胎位置上方的卵表面上(对照组则吸取100 μL蒸馏水涂抹于龟卵表面)[28]。卵孵化过程中，每日检查龟卵状况，若发现龟卵表面出现霉菌斑块或整枚卵霉变而不可孵，则及时清理霉斑或者移除霉变卵。

1.3 幼体大小、翻身表现及学习能力的测定

龟卵孵化后，记录孵出的时间。孵化期以卵带回实验室至孵出为止的时间间隔表示，孵化成功率以各处理组成功孵出卵数占总入孵卵数的百分比表示。幼体孵出后，检查畸形情况，用Mettler-Toledo电子天平测量体质量。

待孵出幼体腹部卵黄完全吸收后，测定其翻身表现。幼体翻身表现在温度设置为29 ℃的人工气候室中进行。测试开始前，将含有幼体的玻璃饲养缸(不含水)放置于人工气候室1 h以使其体温达到相应水平，并适应实验室测试环境。待测的幼龟放置于小方盒(20 cm×10 cm×7 cm)中并迅速将其翻转(背部朝下，腹部朝上)。方盒正上方架有垂直向下的Panasonic数码摄像机(型号：HDC-HS900, Panasonic corporation, Osaka, Japan)同时记录幼龟的翻身过程。翻身测试以10 min为限，若幼龟在该限期内未能成功翻身，则判定为翻身失败。实验结束后，视频片段用MGI Video Wave III软件(MGI Software Co., Canada)读出，翻身时间以幼龟翻转至翻身成功的时间间隔表示。

幼龟翻身表现测试结束后，单独饲养于含水约3 cm高的饲养缸，并放置于29 ℃人工气候室内。每隔3 d换水，待幼龟开食后，每日投喂适量商业化幼龟饲料。幼龟孵出约1个月后，测定其学习能力。幼龟学习能力测定在自制的玻璃十字迷宫中进行(图1)[32]。十字迷宫内含高约3 cm的水，放置于29 ℃人工气候室。学习能力测定前，幼龟禁食3 d。禁食结束后，幼龟移入十字迷宫内(A端)自行寻找食物2 d。将单只幼龟放入迷宫的一端，适量饲料放于其呈直角的一端(B端)。幼龟自由觅食，摄食后放回原饲养缸。之后2 d，在相同迷宫臂一端继续投放食物，但于投放点前布以网孔的透明隔板使幼龟不能获取食物。训练结束后，撤掉投放点隔板，随机选取幼龟移至训练时一致的十字迷宫臂端。迷宫正上方架有垂直向下的Panasonic数码摄像机以记录整个测试期间的幼龟活动情况，视频片段自动记录于计算机。迷宫实验限定时间为20 min，20 min内未找到食物则记为失败。获得的视频片段用SMART视频行为学分析系统(Vision 2.5, Panlab Inc., Barcelona, Spain)进行轨迹分析，记录幼龟从放入迷宫至找到食物所用的时间和在迷宫内移动的总距离。

1.4 数据处理

200 mg·L-1处理组因实验过程中操作失误(卵被摔碰)使其中20枚卵不可孵，相应的数据并未用于后续统计分析。所有的数据用Statistica 6.0软件包进行统计分析。在参数统计分析前，用Kolmogorov-Smirnov检测验证数据正态性；用Bartlett检验验证数据方差同质性。用以入孵卵质量为协变量的单因子协方差分析检测草甘膦铵盐处理对孵出幼体大小的影响；用似然比检验(G检验)检测不同处理下卵孵化成功率的差异；用单因子方差分析检测草甘膦铵盐处理对乌龟孵出幼体翻身表现和学习能力的影响；用Tukey检验进行多重比较。

图1 乌龟学习行为测量的示意图Fig. 1 The diagram of the apparatus used for learning behavioral measurement of turtles

2 结果(Results)

2.1 不同浓度草甘膦铵盐处理对乌龟胚胎发育的影响

不同浓度草甘膦铵盐处理组下孵入的乌龟卵大小(卵质量)无显著差异(表1)。草甘膦处理对乌龟卵孵化成功率、孵化时间以及孵出幼体大小均无显著影响(表1)。在各处理组孵出幼体中也未发现具明显畸形的情况。

2.2 不同浓度草甘膦铵盐处理对乌龟幼体翻身和空间学习能力的影响

幼体翻身测试中，仅少数个体未在实验规定时间内完成翻身动作，相应个体的数据未用于后续统计分析。不同浓度草甘膦铵盐处理对乌龟孵出幼体翻身表现的影响不显著(F4, 105= 2.11,P= 0.085)(图2)。迷宫实验中，未完成觅食行为的相应个体数据也未用于后续的统计分析。不同浓度草甘膦铵盐处理下孵出幼龟觅食时间存在显著差异(F4, 65= 7.58,P< 0.001)(图2)，200和2 000 mg·L-1浓度处理组孵出幼体的觅食时间显著延长。高浓度的草甘膦铵盐处理组的孵出幼体在迷宫中移动距离比低浓度处理组幼体更短，然而在统计上移动距离的组间差异是边缘性的(F4, 65= 2.45,P= 0.055)(图2)。

3 讨论(Discussion)

胚胎发育期是动物整个生活史中最脆弱的阶段，胚胎直接暴露于某些环境污染物可能影响个体后续发育阶段的生长与功能表现。本研究用0～2 000 mg·L-1范围内不同浓度的草甘膦铵盐处理孵化中的乌龟卵，发现草甘膦铵盐暴露不影响乌龟胚胎发育速率、孵出幼体大小，但潜在地影响其觅食表现，从而可能对其后期生长与存活产生负面效应。

草甘膦铵盐暴露对乌龟卵孵化成功率、孵化时间和孵出幼体大小无显著的影响。虽然草甘膦暴露对水生生物遗传、生理和行为等方面的影响广泛，但总体上仍然认为草甘膦制剂的毒性属于低毒。本研究表明，草甘膦铵盐暴露未造成发育中的乌龟胚胎直接死亡也不改变其发育速率，这一结果是可以预见的。相似的结果也见于其他物种。例如，0～5 000 mg·L-1浓度范围内的草甘膦铵盐暴露对中华鳖卵孵化成功率、胚胎发育速率和孵出幼体大小无影响[28]；68～1 501 mg·L-1草甘膦处理对红耳滑龟卵的孵化成功率和孵出幼体大小影响不大，仅在11 206 mg·L-1浓度处理下孵化成功率较低、孵出幼体较小[26]。相似地，龟鳖类动物胚胎期经历另一些农药低浓度暴露，也没有影响胚胎发育速率和孵出幼体体型大小。例如，0.004～0.1 mg·L-1的溴氰菊酯暴露并不会对红耳滑龟和乌龟孵出幼体大小和孵化时间产生影响[27]；0.0001～0.1 mg·L-1的阿特拉津暴露也不会对2种地图龟(Graptemysouachitensis和G.pseudogeographica)孵出个体大小和孵化时间产生影响[30]。

在浓度0～2 000 mg·L-1范围的草甘膦铵盐暴露不会影响乌龟幼体的翻身能力。龟类的翻身能力通常直接或间接地反映个体健康情况。在某些情况下，它也被认为是与龟生存直接相关的特性[33-34]。那些翻身迟缓的龟类在自然环境中更容易被捕食，或者受干旱失水等威胁。龟类胚胎发育时所经历的环境(如温度、湿度等因素)都会对孵出幼体的翻身能力产生影响[35]。以往大部分研究发现，胚胎时期的污染物暴露对幼龟翻身能力(例如红耳滑龟胚胎在68～11 206 mg·L-1的草甘膦中暴露)的影响较小[26]。仅少数研究表明，污染物暴露导致龟类翻身能力降低。例如，Meter等[25]发现无论是暴露于原油还是多环芳烃都对北美拟鳄龟幼体的翻身能力产生显著影响。

表1 不同浓度草甘膦铵盐处理下乌龟入孵卵质量、孵化时间及孵出幼体大小Table 1 Egg mass, incubation length and hatchling body mass of Mauremys reevesii under different concentration treatments of glyphosate-ammonium

图2 不同浓度草甘膦铵盐处理组乌龟幼体翻身时间、觅食时间及觅食距离注：柱上方的不同字母表示平均值差异显著，Tukey’s test，a>b。Fig. 2 Righting time, foraging time and movement distance during foraging of Mauremys reevesii hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammoniumNote: Different letters above the vertical bars denote significant differences, Tukey’s test, a>b.

寻找定位重要的环境资源，如食物、水和遮蔽处，对水生动物的生存至关重要。空间学习表现反映了动物在搜寻食物时能否快速准确地定位并找到食物的能力，亦可反映在逃避捕食者时能否及时有效地避开危险境地的能力[36]。本研究显示，草甘膦铵盐暴露潜在地影响乌龟幼体的空间学习能力，例如，较高浓度草甘膦铵盐暴露下孵出幼体的觅食时间较长，在整个觅食过程中其移动距离似乎也较长。以往的研究发现，一些污染物暴露也会影响动物的空间学习能力。例如，硫丹、氟氯氰菊酯和新烟碱类等杀虫剂会对意大利蜜蜂(Apismellifera)[37]、欧洲熊蜂(Bombusterrestris)[38]的空间学习能力造成潜在的影响。此外，重金属铅和杀虫剂毒死蜱暴露对大鼠的空间识别能力造成影响[39-40]。动物的学习和记忆的能力与胆碱能神经系统密切相关[41]，污染物暴露可以通过影响胆碱能神经系统，进而对动物的学习和认知能力产生损伤。例如，草甘膦暴露抑制乙酰胆碱酶等的活性在一些动物(包括鱼类和蛙类蝌蚪)中已得到证实[42-43]，但是否与此类动物学习能力相关还需进一步研究。此外，许多的研究已经证实了草甘膦的神经毒性。例如，草甘膦会引起神经元的变性[44]，降低前额皮质、中脑和纹状体中的5-羟色胺和多巴胺水平，从而造成两者代谢物的累积[45]。同样的，在人类研究中发现长期暴露于草甘膦会容易患上帕金森症[46]。

尽管本研究显示，草甘膦铵盐暴露并没有给乌龟胚胎发育以及孵出幼体翻身能力带来明显的胁迫效应，但幼体的空间学习能力可能受到抑制，预示着更深层次(例如神经系统)的负面效应。此外，草甘膦铵盐暴露后幼体觅食时间延长会使其在觅食过程中承担相对较大的被捕食风险，从而增大其后续的生存成本。自然环境中乌龟卵被埋于堤岸边土壤中孵化。施用过草甘膦制剂的农田，经数天时间降解，其土壤中草甘膦残留量不高(通常<1.0 mg·L-1)。因此，自然环境中乌龟胚胎发育受土壤残留草甘膦的毒害作用应不会达到本研究所检测到的程度。