电针抑制PTSD对杏仁核TH的上调和BDNF的下调

朱秀玲，鲁亚平

(1.皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002；2.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000)

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指对目睹或亲身经历的异乎寻常的灾难性、威胁性事件的心理创伤，导致延迟出现或长期持续的精神障碍[1]。PTSD以其发病率高、病程长等特点严重影响人们身心健康而备受关注。PTSD 于严重创伤的应激急性期,海马、下丘脑和杏仁核等处短期内出现神经可塑性改变,神经纤维髓鞘脱失，并且出现代谢的异常[2]，提示这些脑区可能为CNS应激应答敏感区。杏仁核作为边缘系统中重要的组成部分,功能和纤维联系十分广泛,在情绪行为及情绪性学习记忆中起重要作用[3-4],在条件性恐惧的获得、表达和消退中起着关键作用[5-6]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、多巴胺(dopamine,DA)及其相关的酶可能与PTSD发病密切相关，研究发现条件性恐惧记忆形成的不同阶段都受到DA系统的调控[7]；PTSD患者血浆或血清BDNF水平比健康对照人群低[8-11]。目前，PTSD传统药物治疗主要是以三环类抗抑郁剂(如帕罗西汀)为主，但有不同方面副作用，且价格较为昂贵，部分患者治疗无效。现代医学验证针灸有助于治疗创伤后应激障碍[12-14]。电针可能改善认知功能，上调BDNF的表达，促进神经发生[15]。但针灸产生疗效的机制尚不清楚，值得我们进一步研究。本研究采用连续单一刺激(single prolonged stress，SPS)方法制备PTSD模型，观察电针对杏仁核TH和BDNF变化的影响，为进一步探讨PTSD的病理机制及其电针治疗PTSD的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器 成年雄性Wistar大鼠(180～200g)26只,购于江苏省实验动物中心[SCXK(苏) 2009-0001；中国南京],鼠房室温(20±2)°C，适应性饲养1周,自由饮水和摄食。兔抗大鼠TH抗体购自santacruz公司；兔抗大鼠BDNF抗体购自博士德公司；G6805-2B型电针仪购自上海华谊。所有动物实验都要根据中华人民共和国国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的指导原则对动物进行处理。

1.2 实验分组 随机将26只Wistar大鼠分为正常对照组(6只)，模型组、电针组(每组各 10 只)。正常对照组不做任何处理，其余两组进行造模。

1.3 模型制备 采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的关于PTSD样大鼠——SPS模型。将大鼠禁锢2 h，强迫性游水20 min(水深40 cm，水温25℃)，休息15 min后将大鼠用异氟醚麻醉至意识丧失：发现大鼠肢体瘫软、意识丧失后立即取出，放回原笼饲养。采用旷场实验(open-field)法对造模后的大鼠进行行为学检测，根据水平运动次数、垂直运动次数和修饰行为(理毛次数)筛选出12只，6只用于模型组，6只用于电针组。

1.4 电针处理 造模第2天，电针组取“百会”“足三里”穴，用15 mm长的毫针针刺百会(顶骨正中，向前、后斜1～2 mm)和足三里(胫骨前结节外侧5 mm)并接电针仪，采用连续波，频率为2 Hz，双侧足三里交替进行，每次30 min，每日1次，连续21 d。

1.5 组织标本制备 大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉后，剪开胸腔暴露心脏，经左心室-升主动脉插入穿刺针，先用0.9%生理盐水进行心脏灌注。死亡后取脑组织，置于4%的多聚甲醛溶液24 h后，取出脑组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡Ⅰ和石蜡Ⅱ完成石蜡包埋。

1.6 免疫组化、结果检测，灰度值测定及细胞计数 石蜡切片机切出约为5 μm的组织切片，贴于用多聚赖氨酸处理过的载玻片上后置于60℃烘箱2 h，随后按照抗体说明书分别进行TH和BDNF的免疫反应和显色步骤，用PBS代替一抗,作为阴性对照反应。参照Paxinos and Watson(1986)图谱，在光镜下观察杏仁核阳性细胞，平均灰度值测定，阳性细胞计数选用Image J软件。

2 结果

2.1 电针减少PTSD大鼠杏仁核内TH水平 大鼠杏仁核通常分为3个主要的核群：皮质内侧核群(MeA)、基底外侧核群(BLA)、杏仁中央核(CeA)，故又称杏仁复合体。3组大鼠的MeA、BLA和CeA都有TH阳性纤维着色，呈棕色；正常组和电针组中央杏仁核的TH线段数目(n=159、n=179)多于内侧杏仁核(n=47、n=73)。

正常组杏仁核TH阳性纤维着色较弱(图1A、D、G)，模型组杏仁核TH阳性纤维着色较深，统计显示纤维线段的数目较对照组多(表1，P<0.01)，长度较对照组长(图1B、E、H；表1，P<0.01)。相比模型组，电针组TH阳性纤维线段的长度变短(表1，P<0.01)，数目减少(图1C、F、I；表1，P<0.01)。但电针组与对照组间TH阳性纤维线段的数目和长度差异均无统计学意义(表1，P=0.05)。

2.2 电针增加PTSD大鼠杏仁核内BDNF水平 3组大鼠的MeA、BLA和CeA都有BDNF阳性染色，胞浆与胞膜着色，呈棕色。正常组杏仁核BDNF阳性细胞，胞体大而圆，细胞数目较多，染色较深(图2A、D、G)。模型组杏仁核BDNF阳性细胞，胞体较小，细胞排列稀疏，染色较浅(图2B、E、H)。电针组杏仁核BDNF阳性细胞，胞体大而圆，细胞数目较多，染色较深(图2C、F、I)。模型组BDNF的强度及细胞数目(n=17)较正常对照组(n=55)减少(P<0.01)。电针组BDNF的强度及细胞数目较模型组增加(n=64)(P<0.01),且电针组BDNF与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，见表2。

表1 PTSD及电针对大鼠杏仁核内TH免疫反应性的影响

*P<0.01，与正常组相比；△P<0.01，与模型组相比。

表2 PTSD及电针对大鼠杏仁核内BDNF免疫反应性的影响

组别外侧杏仁核nx±s内侧杏仁核nx±s中央杏仁核 nx±s正常组124148.58±8.79228139.00±15.58208150.12±12.35模型组60177.52±8.01#60168.98±9.16#36188.44±10.06#电针组188150.96±9.97∗＄208150.77±12.45∗＄＄208161.39±10.67∗＄＄F222.752123.978185.965P0.0000.0000.000

#P<0.01，与正常组相比；*P<0.01，与模型组相比；＄P<0.05，＄＄P<0.01，与正常组相比。

A～C.BLA。A.正常组；B.模型组；C.电针组。D～F.MeA。D.正常组；E.模型组；F.电针组。G～I.CeA。G.正常组；H.模型组；I.电针组。比例尺=16 μm。免疫组织化学SABC法。

图1 大鼠杏仁核内TH免疫反应结果

A～C.BLA。A.正常组；B.模型组；C.电针组。D～F.MeA。D.正常组；E.模型组；F.电针组。G～I.CeA。G.正常组；H.模型组；I.电针组。比例尺=16 μm。免疫组织化学SABC法。

图2 大鼠杏仁核内BDNF免疫反应结果

3 讨论

创伤后应激障碍是指对目睹或亲身经历的异乎寻常的灾难性、威胁性事件的心理创伤，导致延迟出现或长期持续的精神障碍[1]。PTSD于严重创伤应激急性期,海马、下丘脑和杏仁核等处短期内出现神经可塑性改变,提示这些脑区可能为CNS应激应答敏感区。

杏仁核作为边缘系统中重要的组成部分,功能和纤维联系十分广泛,在情绪行为及情绪性学习记忆中起重要作用[2-3],在条件性恐惧的获得、表达和消退中起着关键作用[4-5]。其中感觉的输入和处理主要靠BLA与外侧杏仁核(LA)管理,而恐惧行为的表达主要靠CeA管理[16]。BDNF由神经细胞产生，通过与其受体 TrkB 的结合启动细胞内信号转导途径，发挥神经保护作用[17],当有抗伤害性刺激时,BDNF可促进神经元损伤后的再生和生理功能的恢复[18]。临床研究表明，PTSD患者血浆或血清BDNF水平比健康对照人群低[7-9]。

本研究结果显示正常组杏仁核BDNF阳性细胞，胞体大而圆，细胞数目较多，染色较深；模型组BDNF的强度及细胞数目较正常对照组减少，细胞稀疏；说明SPS刺激损伤杏仁核(MeA、BLA和CeA)神经细胞，这与以前的研究结果PTSD大鼠杏仁核神经元细胞凋亡，PTSD造成杏仁核体积变小一致。电针治疗后，电针组BDNF的染色强度及细胞数目较模型组增加，表明电针对PTSD大鼠的脑神经细胞有保护作用,有效促进神经保护因子的表达，增加神经细胞存活数，减轻SPS应激对神经细胞的损伤。BDNF在不同组中的变化可能是BDNF本身表达的改变引起，需要原位杂交来进一步确认。酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺类神经递质去甲肾上腺素、DA、肾上腺素合成的限速酶。DA可能是与警觉性高、偏执、对创伤线索的敏感性和记忆密切相关的一种神经递质。

苏珊珊等研究表明，DA系统调控着条件性恐惧记忆形成的不同阶段。在PTSD的发病过程中DA扮演着重要作用。有研究显示，PTSD患者血浆和尿液中DA水平与PTSD的严重程度成正相关。解剖学研究表明DA D1和D2 受体在杏仁核均有高度表达。研究表明杏仁核接受来自中缝核5-羟色胺，来自蓝斑的去甲肾上腺素，及来自中脑腹侧被盖的多巴胺能传入纤维。

本研究结果显示正常组杏仁核TH纤维线段的数目及长度较弱；模型组杏仁核TH纤维线段的数目及长度较正常组增高；这表明在模型组，传入杏仁核的儿茶酚胺类递质神经纤维增多，杏仁核在应激状态下极度活跃。表明杏仁核在PTSD中表现为敏感性增高，并且它的激活与PTSD症状的严重程度成正比[19-20]。本实验电针组TH纤维线段的长度表达变短，其染色强度较模型组降低，这表明电针可能抑制了活跃的杏仁核，减少了儿茶酚胺类递质的纤维传入。TH在不同组中的变化可能是TH本身表达的改变引起，需要原位杂交来进一步确认。

因此，电针可能同时通过减少儿茶酚胺递质的纤维传入和有效促进神经保护因子的表达等综合效应达到防治PTSD的作用。