1株耐多种重金属菌株的分离鉴定

刘士尧，刘珮熠，徐羽丰，龙云飘，牛晓磊，李春霞，陈银华，陶 均

(海南大学 热带农林学院/海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海口 570228)

海南昌江石碌铁矿是大型的露天铁矿床[1]，形成于大型火山沉积、变质等过程，富含多种重金属[2-3]。昌江县属于典型的热带季风气候区，终年高温，旱雨季明显，植被繁茂，然而石碌铁矿尾矿场却地表裸露，植被稀少，这反映出其土壤中重金属环境复杂。这样特殊的地质环境与气候特性相结合给极端微生物制造了得天独厚的生长环境，也会孕育出一批具有特殊功能的微生物群落。重金属污染是中国乃至世界各国快速发展中都会遇到的环境问题[4-5]。重金属污染多为多种重金属复合型污染，而非单一化学元素污染，其污染主要来自采矿、冶炼、化工等行业不合理排放，以及农药化肥的不合理使用。Friesl W等研究表明，在工业矿区和污灌区的重金属污染主要以Cu，Cd，Pb等元素为主，在废旧电池处理工厂，Pb，Cu，Zn 等重金属元素也严重超标[6-7]。土壤中的多种元素以及其他化合物复合污染形势已经日趋严峻，其间复杂的相互作用也增加了环境修复的难度。目前，土壤重金属修复主要通过物理方法、化学方法和生物方法，但上述方法仅针对单一元素的土壤污染修复进行研究，而针对多种元素复合型污染的相关研究较少[8]。研究重金属复合污染的土壤修复技术是未来的发展趋势和方向。笔者在海南石碌矿区的土壤样品中发现了1株对多种重金属具有耐受力的菌株，并对其进行分离鉴定，旨在为土壤重金属污染修复提供参考。

1 材料与方法

1.1土壤本实验所用土壤采集于海南昌江石碌矿区(北纬19°14′东经109°4′)表层5～10 cm的土壤，采取5份样品，土壤样品装于无菌土壤样品瓶中，取部分土壤进行实验，其余样品贮存在4 ℃的冰箱中备份待用。根据文献记载，此处土壤中Cu，As，Fe超过同类土壤环境质量标准[9]。

1.2试剂本实验PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，测序服务来自华大基因(广州)公司，其他化学试剂购自广州化学试剂公司和Sigma-Aldrich。

1.3培养基Luria-Bertani (LB) 培养基： 10 g胰蛋白胨，10 g氯化钠 ，5 g 酵母提取物，蒸馏水定容至1 L，pH7.0～7.2。筛选培养基：LB培养基+各种不同浓度的金属离子。

1.4菌株的筛选与分离取土样5 g装入含有45 mL无菌水的离心管中，充分混匀后1 867 r·min-1离心2 min，取上清并稀释制成10-2，10-3，10-4悬液备用。

配制不同铜离子(Cu2+)质量浓度(10，50，100，250，500，1 400 mg·L-1)的LB固体培养基，并用高压蒸汽锅灭菌。取质量分数为10-2，10-3，10-4的土壤悬液各100 μL涂布在含铜离子浓度不同的培养基上，每种浓度3个重复，28 ℃培养箱培养1～5 d。观察培养基上细菌的生长状况，筛选出菌株的最大耐受范围。

挑取在最高质量浓度Cu2+培养基上生长的单菌落，再按平板划线法进行培养，观察长出菌落是否单一且一致，如果不满足条件，则继续平板划线法培养直至菌落形态单一、一致。

将筛选到的菌株置于含Cu2+质量浓度分别为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000，1 200 mg·L-1的液体培养基中进行再次筛选，检测得到菌株在液体环境中的最大耐受程度及最适合的生长环境。

1.5菌株的鉴定

1.5.1 形态学鉴定将通过筛选获得的菌株划线于LB固体培养基上得到单菌落，观察菌落大小、颜色、形状、凸起、透明度等，并进行革兰氏染色，观察染色的阴阳性和菌体形态。根据以上表型对比分析菌株类型。

1.5.2 分子生物学鉴定利用细菌16S rRNA基因进行鉴定，利用其通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增测序。将检测无误的纯化片段送华大基因(广州)公司进行测序，通过NCBI中的BLAST方法进行分析，并与NCBI里9株其他细菌的16S rDNA序列进行比对，应用MEGA6.06软件利用最大似然法构建系统发育树。

1.6菌株的最适生长条件的测定

1.6.1 菌株的最适pH将菌株以体积分数为1%的量分别接种于不同pH值(pH为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)的液体培养基(5 mL)中，3次重复，180 r·min-1，28 ℃条件下振荡培养，24 h后测定光密度值OD600。

1.6.2 菌株的最适温度将菌株以体积分数为1%的量分别接种于多个10 mL培养基中，分别放置于24，26，28，30，32，34，36 ℃进行培养，每个温度3个重复，180 r·min-1，pH6.0条件下进行振荡培养，24 h后测定光密度值OD600。

1.6.3 菌株的最适渗透压将菌株以体积分数为1%的量分别接种于NaCl不同终质量分数(0，0.5%，1%，1.5%，2%，3%)的液体培养基进行培养，每个终质量分数为3个重复，180 r·min-1，34 ℃，pH6.0条件下进行振荡培养，24 h后测定光密度值OD600。

1.7菌株对Pb2+和Cd2+耐受性的影响配制含Pb2+质量浓度分别为100， 300， 500， 700， 900， 1 100，1 300，1 500，1 700 mg·L-1；Cd2+质量浓度分别为50，100，150，200，250，300 mg·L-1的液体培养基，接种并培养菌株，24 h后测定OD600值。得到浓度后将3种金属以组合的方式加入到液体培养基中(①Cu，Pb；②Cu，Cd；③Pb，Cd；④ Cu，Pb，Cd)，接种并培养菌株，24 h后测定OD600值。

2 结果与分析

2.1耐Cu2+菌株的筛选土壤悬浮液经过1 400 mg·L-1Cu2+平板培养分析后，挑取6个差别明显、个体较大的单菌落(菌株命名为：Cu-1，Cu-2，Cu-3，Cu-4，Cu-5，Cu-6)进行金属浓度梯度培养，每个梯度3个重复，筛选耐Cu2+能力最强的菌株。

表1 6株菌株在不同铜离子浓度下的生长情况

注：生长良好：+++ 生长一般：+ 不生长：—

Notes: Normal growth: +++; weak growth: + ; none:—

从表1可知，有4株菌株能在含800 mg·L-1Cu2+的液体培养基中生长。由于Cu-6菌株稳定性最好，故本次研究主要讨论菌株Cu-6。

本实验筛选出的菌株是从矿区土壤中直接分离得到的，菌株并未经过高浓度重金属离子的驯化，表明菌株是天然耐Cu2+菌株，长期在Cu2+含量高的土壤中生存，对Cu2+毒性有较高耐受能力。经传代实验(5次转接)验证其Cu2+耐受性具有遗传稳定性，这种特性利于将其应用于实际土壤修复中。

2.2菌株鉴定从图1可见，Cu-6菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，不透明，边缘整齐。从图2可见，革兰氏染色呈阴性，为短粗杆菌。

图1 菌株Cu-6在LB培养基上划线的生长 图2 革兰氏染色结果

16S rDNA为原核生物所共有，其功能同源且最古老，既含有保守序列又含有可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相对应。为得到可靠的种属鉴定结果，对该菌株进行16S rDNA序列鉴定，以菌株Cu-6 的DNA为模板，通过PCR扩增得到长度约为1 500 bp的片段(图3)。

测序得到Cu-6菌株的16S rDNA长度1 441 bp。通常，如果2个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5%, 则认为属于同1个分类单位。将菌株Cu-6的16S rDNA基因部分序列与其他细菌的相应序列进行比对(表2)，同时运用MEGA构建Cu-6菌株的系统发育树(图4)。结果显示，菌株Cu-6属于阴沟肠杆菌属，通过BLAST和伯杰鉴定法确定待测菌株Cu-6属于阴沟肠杆菌属(Enterobactercloacae)

表2 16S rDNA blast结果

2.3菌株的最适生长条件

2.3.1 菌株最适pH从图5-A可知，菌株Cu-6在pH6.0时生长状态好，表明pH6.0为其生长最佳pH。重金属离子在酸性条件下可溶，当溶液偏向中性及碱性时会形成沉淀,不利于对污染土壤的治理。海南土壤环境是偏酸性的，菌株生长的最佳pH值也是酸性的，与其生长环境一致，有可能用于修复海南重金属污染的土壤。

图4 Cu-6菌株系统发育树

2.3.2 菌株最适温度从图5-B可知，菌株Cu-6在34 ℃生长较好，更高温度(36 ℃)也能生长，说明其具有一定的耐热性。

2.3.3 菌株最适渗透压从图5-C可知，菌株在NaCl终质量分数小于1.5%的培养基中生长状态良好，当 NaCl 质量分数增加到 2%，3%时，细菌仍能生长，说明该菌株具有较强的盐耐受能力，能在离子强度较高的环境中生存，具有很好的渗透压调节能力。

2.4Pb,Cd及其与Cu混合溶液对菌株生长的影响从图6-A可知，菌株在含300 mg·L-1Pb2+的培养基中生长最好，进一步提高Pb2+质量浓度时，对菌株生长没有较大影响，即使在含1 700 mg·L-1Pb2+的培养基中也能生长，表明筛选出的菌株具有较强铅耐受性。

菌株在含Cd2+50 mg·L-1的培养基中生长良好(图6-B)，说明筛选出的菌株具有较强镉耐性，进一步提高Cd2+质量浓度至150 mg·L-1时，细菌仍然能够生长，再提高Cd2+质量浓度将显著抑制菌株生长。

由图6-C可知，菌株在400 mg·L-1Cu2++ 300 mg·L-1Pb2++150 mg·L-1Cd2+的混合溶液中振荡培养24 h后仍能生长良好，显示出菌株在复杂金属胁迫环境中仍然有很强的生存能力，有利于细菌在复杂重金属污染土壤中生存。

3 讨 论

近年来，利用生物技术进行重金属污染修复的研究取得了长足进展，尤其以微生物吸附和植物富集为主[10-11]。而微生物吸附主要依赖于菌株吸附重金属的能力与耐受多种重金属环境的能力，其中，菌株的环境适应能力是其发挥作用的基础条件。例如，康薇等筛选出菌株TLSB2-K (Bacillussp. )的最佳pH是7，最适生长温度为27 ℃，最佳渗透压(NaCl)为1.1%，最高耐Cu2+质量浓度为700 mg·L-1 [12]；王海鸥等筛选出1株耐铜菌株 USTB-E (pseudomonassp.)，最适生长温度为 35 ℃，pH6.0，渗透压(NaCl)为0. 3%，最高Cu2+耐受质量浓度为 560 mg·L-1[13]；李倩等驯化得到耐Cd2+菌株H6 (Bacilluscereus)，最大Cd2+耐受质量浓度为 350 mg·L-1[14]；这些研究都是针对某一种特定的重金属，但对复杂重金属污染土壤的实际作用有限。

本实验采用常规纯培养方法从矿区土壤中分离筛选耐重金属微生物，并获得1株耐铜、铅、镉能力强的阴沟肠杆菌菌株Cu-6。吴海江等筛选和分离获得了1株耐受200 mg·L-1Cd2+的阴沟肠杆菌[15]，其耐Cd2+水平略高于菌株Cu-6的150 mg·L-1，但其菌株的复合耐受水平较弱。SETHURAMAN P. 等也发现了对铅、镉的耐受能力分别为300，200 mg·L-1的阴沟肠杆菌，但对铅镉的复合抗性较小[16]。笔者筛选的Cu-6菌株分别能在含800 mg·L-1Cu2+，1 700 mg·L-1Pb2+，150mg·L-1Cd2+的培养基中生长，表明此未经驯化菌株对铜、铅、镉的耐受能力明显优于已发现的菌株。

国内外学者的大量研究表明，微生物对重金属的耐受机理比较复杂，主要用通过其菌体表面吸附与络合效应、静电结合、离子交换型吸附、氧化还原、胞外沉淀、胞内累积效应等方式实现[17-18]。阴沟肠杆菌的耐受机理，可能是依靠胞外沉淀方式来实现[15]，菌株Cu-6的耐受机理可能与之相似，但其具体耐受机理还需要进行更深入的研究。菌株Cu-6良好的复合重金属耐受性与良好的环境适应能力暗示其可能具有对海南土壤重金属污染修复的潜力。

DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20170632)[2018-10-08].http:∥www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-WSXB20180404001.htm.